柽柳bZIP基因的克隆及耐盐功能研究

论文摘要

从柽柳cDNA文库中得到两条bZIP序列TabZIP1和TabZIP2。利用5’RACE方法获得TabZIP1基因的全长cDNA序列,TabZIP1基因cDNA全长1609bp,其中开放读码框（ORF）为1419bp,编码472个氨基酸组成的蛋白。预计分子量为51.9kD,理论等电点为6.44。柽柳cDNA文库中得到另一条bZIP家族全长序列TabZIP2。该序列全长为760bp,开放阅读区全长为435bp,共编码144个氨基酸预计蛋白的分子量为16.5kD,理论等电点为6.60。利用实时定量RT-PCR技术研究了TabZIP1基因在柽柳中对胁迫处理的表达。结果表明,TabZIP1基因可以被NaCl胁迫诱导表达,在胁迫24 h TabZIP1基因在柽柳中表达量最高,是对照（0 h）表达量的8.6倍,在NaHCO3胁迫下,TabZIP1基因的表达都被抑制,表达量均低于对照（0 h）。将TabZIP2构建到植物表达载体pROKII中,形成重组质粒pBZIP2。通过农杆菌介导的烟草的遗传转化,使外源基因整合到烟草基因组中。对转化植株的PCR检测初步证明外源基因已经整合到烟草基因组中。选取4个转基因株系进行了NaCl胁迫试验,分析逆境胁迫条件下非转基因植株和这些转基因植株的POD活性、SOD活性、丙二醛（MDA）含量、相对电导率、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、相对生长率、相对含水率等指标的变化。结果显示,在胁迫4d时,转基因株系的POD活性、SOD活性、可溶性蛋白含量达到最大值,并且明显高于对照。MDA含量和相对电导率在胁迫4d时有下降的趋势,7d时上升,且转基因株系均低于对照株系。可溶性糖的含量在胁迫1d时有的株系（B13、B18）已经达到最大值,含量高于对照。从烟草的生长状况看,转基因的相对生长量高于对照。研究结果表明,TabZIP2基因可能通过调控增强植物体内活性氧清除能力、增加可溶性糖含量、调控可溶性蛋白的合成来提高植物对盐胁迫耐受能力。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 转录因子的研究概况
• 1.2.1 转录因子的结构
• 1.2.2 转录因子在逆境抗性基因工程中的应用
• 1.3 植物bZIP（碱性亮氨酸拉链）蛋白研究进展
• 1.4 立题目的、意义
• 2 柽柳bZIP基因的克隆
• 2.1 试验材料与试剂
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株与质粒
• 2.1.3 酶及化学试剂
• 2.1.4 试剂盒
• 2.1.5 引物
• 2.1.6 测序
• 2.1.7 主要仪器
• 2.1.8 DNA和蛋白质序列分析
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 柽柳总RNA的提取
• 2.2.2 cDNA第一链的合成
• 2.2.3 TabZIP1基因的5'RACE
• 2.2.4 RACE片段的克隆与测序
• 2.2.5 bZIP基因在柽柳中的表达研究
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 TabZIP1基因序列、结构及功能分析
• 2.3.2 TabZIP2基因序列、结构及功能分析
• 2.4 本章小结
• 2.5 讨论
• 2.5.1 RACE技术
• 2.5.2 TabZIP1在柽柳中的表达
• 3 柽柳TabZIP2基因在烟草中的功能分析
• 3.1
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 主要试剂
• 3.2 方法
• 3.2.1 TabZIP2植物表达载体的构建
• 3.2.2 农杆菌感受态的制备及电击转化
• 3.2.3 烟草的遗传转化
• 3.2.4 转化烟草的PCR检测
• 3.2.5 转化烟草的Northern杂交
• 3.2.6 转化烟草的Southern杂交
• 3.2.7 转基因烟草植株的耐盐性分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 TabZIP2植物表达载体的构建
• 3.3.2 农杆菌重组质粒的PCR鉴定
• 3.3.3 烟草的遗传转化
• 3.3.4 TabZIP2基因烟草植株的分子鉴定
• 3.3.5 转基因烟草植株的耐盐性分析
• 3.4 本章小结
• 3.5 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢