甲壳动物血蓝蛋白免疫学活性及其作用机制研究

论文摘要

目前我国是世界上最大的甲壳动物（虾蟹）集约化养殖生产国。然而,与国际虾蟹养殖业相比,我国商业化的虾蟹养殖整体效益较低,可持续发展前景不容乐观。究其原因,主要与虾蟹病害和生物安全等有关。为此,学者们认为选育优质、抗逆优良虾蟹品种,建立安全、生态、环保的健康养殖模式,是解决目前虾蟹养殖疾病,提高虾蟹品质的有效途径。要成功解决这些问题,关键环节之一就是揭示虾蟹自身免疫防御机制,寻找虾蟹病害防治的有效方法。近年来研究表明,存在于对虾等无脊椎动物血淋巴中的血蓝蛋白是一种具有抗病毒和抗细菌等多种免疫活性的多功能蛋白。本研究以凡纳滨对虾、锯缘青蟹血蓝蛋白为研究对象,在国内外所获研究结果的基础之上,进一步对其免疫学活性及作用机理等进行了深入的研究,所获研究结果具体如下:1、发现凡纳滨对虾血蓝蛋白抑菌活性与其糖基化修饰有关,且OmpC为其抑菌作用靶标之一首先,在本课题组已分离得到的2种糖含量和抑菌活性存在显著差异的凡纳滨对虾血蓝蛋白（LHt和LH75）的基础之上,本研究采用凝集素印迹、Tricine-SDS-PAGE和HPLC等技术,进一步发现LH75、LHt糖基化修饰存在显著性差异,其中前者α-D-甘露糖、α-D-葡萄糖修饰程度比后者高;前者胰酶水解肽段分子量明显高于后者;前者胰酶酶解HPLC图谱表现为10个峰,而后者为24个峰。同时,2-DE显示,LHt主要蛋白点为7个,大小亚基分别为3和4个点,LH75主要蛋白点为6个,大小亚基分别为4和2个点。由此说明该2种血蓝蛋白不仅在蛋白质水平存在差异,其糖基化修饰也存在差异。继而,选用副溶血弧菌人工感染对虾,发现对虾刺激后虾血清中LHt、LH75表达均呈上升趋势,且LH75上升幅度明显高于LHt。结合前期研究发现LH75抑菌活性显著高于LHt抑菌活性的研究结果,提示LH75可能是血蓝蛋白发挥抑菌作用的重要组分,其抑菌活性应该与糖基化修饰有关。最后,利用亲和孵育获得3种与LH75相结合的副溶血弧菌外膜蛋白（Omp）, p1、p2和p3,经质谱鉴定p2为OmpC,根据前期研究发现LH75对外膜蛋白敲除菌△OmpC的抑菌活性明显降低的结果,推测OmpC应为为LH75抑菌作用靶标之一,至于其是否还存在其他作用靶标还有待于进一步研究和证实。2、发现锯缘青蟹血蓝蛋白具有凝集活性,凝集作用靶标为OmpA和OmpX首先,采用亲和蛋白质组学策略,发现锯缘青蟹血蓝蛋白由分子量分别为70、72、75、76、80 kDa的5个亚基组成,其与岸蟹（Carcinus aestuarii）、蓝蟹（Callinectes sapidus）和黄道蟹（Cancer magister）血蓝蛋白亚基具有高度的同源性,且3个主要亚基（p75、p76和p80）与兔抗虾血蓝蛋白抗血清呈显著阳性,说明所获得的青蟹血蓝蛋白成分单一、可靠,适合于进一步研究。继而,采用凝集实验和凝集抑制实验,发现青蟹血蓝蛋白对副溶血弧菌、溶藻酸弧菌、河弧菌、哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌、大肠杆菌K12和金黄色葡萄球菌等7种细菌具有凝集活性,且其凝集活性能被葡萄糖、半乳糖、木糖和N-乙酰神经氨酸部分或完全抑制。说明青蟹血蓝蛋白确实具有凝集活性。最后,运用SDS-PAGE、Western-blotting、凝集抑制实验、基因敲除凝集实验等发现青蟹血蓝蛋白凝集活性作用亚基为76 kDa亚基;大肠杆菌Omp能够抑制血蓝蛋白对7种细菌的凝集活性;与大肠杆菌K12野生菌株相比,血蓝蛋白对△OmpA和△OmpX凝集活性明显降低。由此推测,青蟹血蓝蛋白可能主要依赖其76 kDa亚基,通过与病原菌OmpA和OmpX相结合而发挥凝集活性。3、发现锯缘青蟹血蓝蛋白具有溶血活性,溶血作用机制为胶体渗漏机制采用溶血实验发现锯缘青蟹血蓝蛋白对鸡、鼠、兔、人等多种红细胞表现出依赖于钙离子的溶血活性。其溶血活性具有“剂量-效应”效应,同时对pH、温度敏感,在pH 5-8范围内,溶血活性随pH上升而降低;随着温度的升高,溶血活性逐渐增强, 37℃时溶血活性达到100%。在上述研究的基础之上,进一步采用SDS-PAGE、Western-blotting、渗透保护实验等,发现锯缘青蟹血蓝蛋白5个亚基均可与红细胞膜相结合,且青蟹溶血活性随着渗透保护剂分子的增大而降低。由此推测,青蟹血蓝蛋白可能依赖其全部亚基通过胶体渗漏机制而发挥溶血活性。综上所述,本课题研究主要发现:甲壳动物（虾、蟹）血蓝蛋白具有凝集活性、抑菌活性和溶血活性,其中凝集、抑菌活性作用靶标为细菌外膜蛋白,溶血作用机制为胶体渗漏机制。所获研究结果为揭示血蓝蛋白的免疫学分子作用机制,阐明血蓝蛋白与病原菌的识别模式奠定了良好的基础,同时为研究血蓝蛋白在虾蟹中的免疫抗病作用提供了较好的实验依据,对丰富和发展甲壳类动物免疫系统的基础研究及指导免疫学防治具有重要的意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语
• 第一章 前言
• 1.1 甲壳动物养殖概况
• 1.1.1 对虾养殖及凡纳滨对虾概况
• 1.1.2 青蟹养殖概况
• 1.2 甲壳动物病害及免疫学防治研究进展
• 1.2.1 甲壳动物病害
• 1.2.2 甲壳动物天然免疫概述
• 1.2.3 甲壳动物免疫学防治研究进展
• 1.3 血蓝蛋白研究进展
• 1.3.1 血蓝蛋白的结构及特性
• 1.3.2 血蓝蛋白功能研究进展
• 1.4 本论文研究的目的与意义
• 第二章 凡纳滨对虾血蓝蛋白抑菌作用分子机制的初步研究
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 溶液配置
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 虾血清的获取
• 2.2.2 硫酸铵分级沉淀纯化抗体
• 2.2.3 亲和层析纯化血蓝蛋白
• 2.2.4 Bradford法测定蛋白浓度
• 2.2.5 双向电泳
• 2.2.6 Westernblotting
• 2.2.7 亲和凝集素点印记分析
• 2.2.8 胰酶水解LHt和LH75
• 2.2.9 Tricine-SDS-PAGE分析LHt和LH75 肽段差异
• 2.2.10 高效液相色谱分析LHt和LH75 胰酶水解肽段差异
• 2.2.11 病原菌刺激后血清中LHt和LH75 量差异分析
• 2.2.12 副溶血弧菌外膜蛋白提取
• 2.2.13 与LH75 相结合的副溶血弧菌外膜蛋白的纯化与鉴定
• 2.2.14 质谱鉴定蛋白
• 2.3 结果分析
• 2.3.1 LHt和LH75 分子结构差异分析
• 2.3.2 两种血蓝蛋白体内抑菌作用相关性分析
• 2.3.3 血蓝蛋白抑菌作用靶点分析
• 2.4 讨论
• 第三章 锯缘青蟹血蓝蛋白凝集活性及其作用靶标分析
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 溶液配置
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 锯缘青蟹血清制备
• 3.2.2 锯缘青蟹血蓝蛋白的纯化和鉴定
• 3.2.3 细菌悬液的制备
• 3.2.4 细菌凝集实验
• 3.2.5 糖抑制实验
• 3.2.6 血蓝蛋白凝集作用活性亚基分析
• 3.2.7 细菌不同成分凝集抑制实验
• 3.2.8 大肠杆菌 K12 外膜蛋白敲除菌凝集实验
• 3.2.9 数据统计分析
• 3.3 结果分析
• 3.3.1 锯缘青蟹血蓝蛋白的纯化与鉴定
• 3.3.2 血蓝蛋白凝集活性分析
• 3.3.3 血蓝蛋白凝集作用亚基分析
• 3.3.4 血蓝蛋白凝集作用靶标分析
• 3.4 讨论
• 第四章 锯缘青蟹血蓝蛋白溶血活性及其作用机制研究
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 溶液配置
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 红细胞悬液配制
• 4.2.2 溶血活性测定
• 4.2.3 溶血动态分析
• 4.2.4 渗透保护实验
• 4.2.5 SDS-PAGE和Western-blotting分析
• 4.2.6 数据统计分析
• 4.3 结果分析
• 4.3.1 血蓝蛋白溶血活性分析
• 4.3.2 锯缘青蟹血蓝蛋白溶血活性影响因素分析
• 4.3.3 锯缘青蟹血蓝蛋白与红细胞膜相互作用分析
• 4.3.4 锯缘青蟹血蓝蛋白溶血作用机制研究
• 4.4 讨论
• 小结与展望
• 参考文献
• 致谢
• 已发表和待发表的论文