中国野葡萄抗白粉病相关基因克隆与黑痘病病原菌的分离

论文摘要

葡萄白粉病（Uncinula necator Schw. Burr.）、黑痘病（Sphaceloma ampelinum（de Bary））是危害欧洲葡萄重要的真菌病害,中国野葡萄对多种真菌病害具有丰富多样的抗性,将中国野葡萄抗性基因和欧洲葡萄品质性状相结合培育抗病优质葡萄新品种具有非常重要的意义。本研究是在课题组前期研究获得中国野生华东葡萄白河-35-1抗白粉病差异cDNA T11GC/B0315-428核苷酸序列的基础上,采用RACE技术克隆了中国野葡萄白粉病抗性基因,并利用生物学软件进行同源性分析。同时我们还对葡萄黑痘病病原菌进行了分离,用形态学、分子学对病原菌进行了鉴定。这些都为下一步通过转基因技术提高欧洲葡萄抗病性奠定了基础。取得了以下主要研究结果:1.根据获得的中国野生华东葡萄白河-35-1抗白粉病差异cDNA T11GC/B0315-428设计特异引物,采用5’RACE与3’RACE克隆了抗白粉病相关基因4条cDNA序列,其大小分别为3029 bp、3031 bp、1894 bp、3031 bp。同源性分析表明,核苷酸及与欧洲葡萄GenBank登录号为AM469847、AM428384、AM428732、AM458893、AM453407、AM481825、AM427026、AM425354、AM453008、AM430212、AM462680等序列同源性达90%以上。2.采用常规组织法对陕西杨凌葡萄黑痘病病原菌进行分离、纯化,共获得病原菌菌株24个,并对菌株YL018进行形态学鉴定、致病性测定及病原菌DNA同源性分析。利用ITS区域通用引物ITS1-F/ITS4进行病原菌DNA PCR扩增,将获得的病原菌rDNA-ITS区域的DNA序列进行Blast比较分析,结果发现菌株YL018与GenBank登录号分别为AY826763、AY826762和AY826764的Elsinoe ampelina位于一个分支上。从而证明分离到了陕西杨凌葡萄黑痘病病原菌。也为进一步研究在病原菌侵染葡萄过程中,植物防御系统中酶类物质的变化及作用做好了前期基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 葡萄白粉病
• 1.1.1 葡萄白粉病菌的起源
• 1.1.2 葡萄白粉病的发病规律和症状
• 1.2 葡萄对白粉病抗性研究
• 1.2.1 葡萄属植物抗白粉病的结构形态学和生理生态学研究
• 1.2.2 葡萄属植物抗白粉病的遗传学研究
• 1.2.3 葡萄属植物抗白粉病的分子生物学研究
• 1.3 葡萄黑痘病
• 1.3.1 葡萄黑痘病的起源和分布
• 1.3.2 葡萄黑痘病发生特点和规律
• 1.3.3 葡萄黑痘病传播途径与发生期
• 1.3.4 葡萄黑痘病发病条件
• 1.3.5 葡萄黑痘病病害防治办法
• 1.4 对葡萄黑痘病的抗性研究
• 1.5 植物抗病基因克隆技术
• 1.5.1 图位克隆法
• 1.5.2 转座子标签法
• 1.5.3 表达序列标签法
• 1.5.4 差异显示技术
• 1.5.5 cDNA 末端快速扩增技术
• 1.6 植物病原真菌的研究方法
• 1.6.1 菌物的分类方法
• 1.6.2 形态学鉴定方法
• 1.6.3 真菌分子生物学鉴定方法
• 1.7 研究目的意义
• 第二章 中国野葡萄抗白粉病相关基因克隆
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 试验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 cDNA 第一链合成
• 2.2.2 5’RACE 与3’RACE
• 2.2.3 RACE 产物克隆测序及序列分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 5’RACE 与3’RACE
• 2.3.2 抗白粉相关基因cDNA 全长序列及序列分析
• 第三章 葡萄黑痘病病原菌的分离鉴定
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 葡萄材料
• 3.1.2 马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基
• 3.1.3 试剂
• 3.1.4 仪器和设备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 黑痘病病菌的分离
• 3.2.2 扫描电镜样本的制备
• 3.2.3 病原菌的孢子、菌丝形态观察及形态学鉴定
• 3.2.4 病原真菌回接试验
• 3.2.5 菌丝培养及收集
• 3.2.6 总DNA 的提取
• 3.2.7 ITS 序列扩增
• 3.2.8 rDNA-ITS 区域核苷酸序列测定与系统发育树构建
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 黑痘病病菌的分离
• 3.3.2 病原菌形态学鉴定
• 3.3.3 致病性测定
• 3.3.4 rDNA-ITS 区域核苷酸序列测定与系统发育树构建
• 第四章 讨论与结论
• 4.1 讨论
• 4.1.1 葡萄属野生种抗白粉病相关基因克隆
• 4.1.2 葡萄黑痘病病菌的分离鉴定
• 4.2 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介