牛奶、鸡蛋过敏原的鉴定、纯化及应用研究

论文摘要

目的：食物过敏是当今重大的卫生学问题,食物过敏原的鉴定、纯化、和标准化是食物过敏性疾病预防和治疗的中心环节。本研究以牛奶、鸡蛋中的过敏原为研究对象,以过敏患者血清中的特异性抗体为探针,对牛奶和鸡蛋中的过敏原组分进行鉴别,并设法将其纯化,作为原料制备包被抗原和酶标抗原,建立食物过敏的双抗原夹心酶免疫检测法,并对其临床应用性能进行考察,为食物过敏诊断试剂的改善和国产化提供实验依据。方法：1.血清收集：从天津市儿童医院检验科收集鸡蛋、牛奶过敏的阳性患者血清及正常对照血清。2.牛奶/鸡蛋过敏原组分的鉴定：提取牛奶/鸡蛋中的总蛋白成分,经SDS-PAGE观察蛋白条带,以牛奶/鸡蛋过敏血清中的特异性抗体作为探针,通过免疫印迹实验鉴定其中的过敏原组分。3.牛奶/蛋清过敏原组分的纯化：在鉴定工作的的基础上,通过去脂、等电点沉淀、盐析、凝胶层析、超滤等手段设法对牛奶/蛋清中的蛋白进行分离和纯化,提取出主要的过敏原组分,并进一步验证致敏性。4.牛奶过敏特异性抗体的双抗原夹心酶免疫检测法的建立：通过ELISA考察牛奶过敏原组分的致敏性,将其进行合理配比制备包被抗原,同时对过敏原组分进行辣根过氧化物酶标记,制备酶标抗原,建立双抗原夹心法检测模式,摸索最佳工作浓度和反应条件。5.双抗原夹心酶联免疫法检测牛奶过敏特异性抗体的初步临床应用：以目前临床应用的进口食物过敏检测试剂作为参考方法,与本实验建立的双抗原夹心法进行比较,测定同一批临床收集的血清标本,计算检测的灵敏度、特异度和阴阳性预测值,比较二者检测结果的符合率,对本研究建立的方法的临床应用效果进行考察。结果：1.牛奶过敏原组分的鉴定：在牛奶总蛋白粗提液中观察到约9个主要蛋白条带；鉴定出其中18kd、14kd、28kd、及70kd附近的多个条带出现阳性反应,推测依次为β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、酪蛋白、以及包括牛血清白蛋白在内的多个大分子蛋白组分。2.鸡蛋过敏原组分的鉴定：在蛋清总蛋白粗提液中观察到约4个主要蛋白条带,蛋黄总蛋白粗提液中观察到10个主要条带;鉴定出蛋清中分子量大约为78kd、43kd、28kd、14kd的多个条带出现阳性反应,判断为卵清转铁蛋白、卵白蛋白、卵类黏蛋白和溶菌酶：在蛋黄中检测到更多的显色条带,但在实验中出现了明显的非特异显色。3.牛奶、蛋清过敏原组分的纯化：通过脱脂、等电点沉淀、凝胶层析、离子交换层析等手段,先后从牛奶中纯化出酪蛋白、大分子蛋白组分（P1）、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白4个过敏原组分,建立了一套完善的纯化工艺;从蛋清中纯化出卵类黏蛋白一个单一组分及数个部分纯化组分。4.过敏原的标记及致敏性考察：用辣根过氧化物酶标记了四种牛奶过敏原组分,并通过单一过敏原组分的酶联免疫吸附实验结果发现,双抗原夹心法的阳性率明显高于间接法,而四种过敏原中,β-乳球蛋白和P1组分的阳性率较高。5.牛奶过敏特异性抗体的双抗原夹心酶免疫检测法的建立及条件优化：根据实验确定配比抗原中各组分的比例为P1：β-乳球蛋白：α-乳白蛋白：酪蛋白=30%：40%：20%：10%,复合酶标抗原中P1、β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、酪蛋白的比例依次为1：1500、1：12000、1：6000和1：6000。最佳包被浓度为50μg/ml,最佳反应时间为1h,最佳血清用量为10μl。6.双抗原夹心酶联免疫法检测牛奶特异性抗体的初步临床应用：用本实验建立的双抗原夹心法ELISA检测模式和德国MEDIWISS Analytic GmbH公司的IVT Allergen Screen食物过敏检测试剂盒同时测定一批临床血清,通过比较二者的测定结果得出该方法的灵敏度为91.304%,特异度为94.286%,阳性预测值（PPV）为91%,阴性预测值为94%,同参考方法有较高的符合率结论：1.鉴定出牛奶中的多个过敏原组分,并成功地从牛奶中纯化出4个过敏原组分,摸索出一套完善的牛奶过敏原纯化工艺。2.鉴定出蛋清中的多种过敏原组分,在鉴定蛋黄中过敏原的实验中发现非特异反应,成功地从蛋清中纯化出一种单一过敏原组分,蛋清过敏原的纯化方法有待进一步改进。3.对牛奶过敏原进行了辣根过氧化物酶标记,建立了牛奶过敏的双抗原夹心酶免疫检测方法,并确定了试剂的最佳工作浓度和反应条件,通过实验证实其检测性能优于传统的间接法酶免疫检测模式,并在初步临床应用中表现出很高的灵敏度和特异度,同临床应用的进口检测试剂有较高的符合率。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语/符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、牛奶主要过敏原的鉴别与分离纯化
• 1.1 对象和方法
• 1.1.1 仪器设备与实验器材
• 1.1.2 重要材料和试剂
• 1.1.3 试剂配制
• 1.1.4 牛奶主要过敏原组分的鉴别
• 1.1.5 牛奶主要过敏原组分的分离纯化
• 1.2 结果
• 1.2.1 牛奶总蛋白组分的提取结果
• 1.2.2 Western-Blot鉴定牛奶总蛋白中的过敏原结果
• 1.2.3 牛奶中过敏原组分的分离纯化结果
• 1.2.4 Western Blot鉴定牛奶纯化组分中的过敏原结果
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 二、鸡蛋主要过敏原的鉴别与分离纯化
• 2.1 对象和方法
• 2.1.1 仪器设备与实验器材
• 2.1.2 重要材料和试剂
• 2.1.3 试剂配制
• 2.1.4 鸡蛋主要过敏原组分的鉴别
• 2.1.5 蛋清主要过敏原组分的分离纯化
• 2.2 结果
• 2.2.1 蛋清/蛋黄总蛋白组分的提取结果
• 2.2.2 Western Blot鉴别蛋清/蛋黄总蛋白组分中的过敏原结果
• 2.2.3 蛋清中过敏原组分的分离纯化结果
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 三、双抗原夹心酶联免疫法检测牛奶特异性抗体的方法学研究
• 3.1 对象和方法
• 3.1.1 仪器设备与实验器材
• 3.1.2 重要材料和试剂
• 3.1.3 试剂配制
• 3.1.4 血清收集
• 3.1.5 酶标反应板的制备
• 3.1.6 酶标抗原的制备
• 3.1.7 间接酶联免疫法检测程序的建立
• 3.1.8 双抗原夹心酶联免疫法检测程序的建立
• 3.1.9 双抗原夹心酶联免疫法的工作浓度确定和反应条件优化
• 3.1.10 牛奶过敏双抗原夹心酶联免疫检测法的初步应用评价
• 3.2 结果
• 3.2.1 酶标抗原的制备结果
• 3.2.2 间接酶联免疫法检测结果
• 3.2.3 双抗原夹心酶联免疫法检测结果
• 3.2.4 双抗原夹心酶联免疫法工作浓度的确定和反应条件的优化
• 3.2.5 牛奶过敏双抗原夹心酶联免疫检测法的临床应用评价
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述 食物过敏原研究进展
• 综述参考文献
• 致谢