貂、狐、貉源犬瘟热病毒分离鉴定与分子生物学特性研究

论文摘要

犬瘟热病毒（CDV）属于副粘病毒科（family Paramyxoviridae）麻疹病毒属（genusMorbillivirus）成员,常引起貂、狐、貉等毛皮动物、犬以及熊猫、虎等珍稀动物大批发病,由于犬瘟热（CD）感染性强、发病急、死亡率高,以及与人类亚急性硬化性全脑炎（subaeute selerosing panencephalitis,SSPE）和多发性硬化症（multiple sclerosing,MS）可能存在联系,一直成为国内外学者研究的热点,但毛皮动物CDV病原学、病理学、诊断、免疫学等研究目前尚不深入。2006年6月至10月间,山东、河北、辽宁等地毛皮动物群大面积暴发犬瘟热。本研究在该病流行病学、临床表现、剖检病变及病理组织学研究基础上,从临床病料中分离获得5个CDV分离株,并进一步从该病毒基因特征、Real-time RT-PCR快速诊断方法和DNA疫苗免疫效果等方面进行了分子生物学特性研究,为毛皮动物群CD防控奠定基础.1.貂、狐、貉群犬瘟热病理学研究:对2006年6月至10月间山东、河北等地区的部分毛皮动物养殖场发生疑似犬瘟热的疫情进行了流行病学、临床表现以及剖检变化观察和分析,并对采集的病料进行了病理学研究。结果表明,这起疫情主要是由携带CDV的貉、貂调运而促进病毒传播感染引起。发病动物剖检病变以全身脏器出血性变化为特征,病情及病变严重程度依次为貉＞狐狸＞水貂。通过对发病狐狸、貉、水貂的肺脏、肝脏、脑、肾脏、膀胱等脏器病理学比较,在病变程度上水貂与狐狸、貉有差异。同一种动物,依病程、病型及有无并发症等因素,病理学变化也存在差异。2.貂、狐、貉源犬瘟热病毒的分离鉴定与生物学特性研究:对流行病学调查、临床症状检查、病理剖检以及病理组织学检查诊断为CDV阳性的发病貉、狐狸和水貂,取其肝、脾、肺、淋巴结及脑混合研磨处理后,分别接种能稳定表达犬信号淋巴细胞活性分子（SLAM）的Vero-DST细胞进行病毒分离,并通过电镜形态观察、RT-PCR检测、理化特性测定和人工感染试验进行鉴定。结果为:5份不同来源的病料接种Vero-DST细胞,36-96h后均产生明显CPE;病毒TCID50分别为10-5.2～-7.3/ml;电镜观察可见多形态病毒粒子,,大小为110-500nm;CDV特异性引物RT-PCR检测5个分离毒株均为阳性;除鸡、鹅红细胞呈微弱阳性外,其余均未见血凝作用;对乙醚、氯仿和甲醛敏感,对酸、碱和热的抵抗力比较弱;5个病毒分离株对乳鼠的LD50分别为2×10-3.8～-4.8/ml,对实验兔无致病性,对貉有明显致病性作用,从而均鉴定为犬瘟热病毒（CDV）,分别命名为CDV/SD/RD06/HT-P（貉源）、CDV/SD/RD06/THD1（貉源）、CDV/SD/M06/HD（貂源）、CDV/SD/M06/LN（貂源）和CDV/SD/F06/HB（狐源）。3.招、狐、貉源犬瘟热病毒不同分离株H和N基因序列分析:用RT-PCR方法对分离的5个CDV分离株的H基因和N基因进行了扩增,并分别将其克隆到PGEMT-Vector,进行序列测定。然后与GenBank中己报道的CDV毒槲目比较。结果为:（1）H基因5个分离株H基因nt序列同源性均达到97.5%以上,与国内疫苗株chn同源性为90.5～91.8%。5个CDV分离株H基因推导的aa列同源性比较表明:HT-P与THD1的aa同源性为100%,二者与其他分离毒株间aa序列同源性差别大,分别为87.9%～99.1%:与chn同源性普遍较低,为89.7%～91.8%。而chn与Onderstepoort、Convac有着很高的同源性关系（nt同源性分别为96.8%和97.2%;aa同源性分别为97.1%和95.6%）.（2）N基因5个分离株N基因nt序列同源性均达到94.5%以上,HT-P与THD1的同源性最高（99.8%）。国内疫苗株chn与分离株的nt序列同源性普遍较低（90.9～93.5%）,而与疫苗株Onderstepoort的nt同源性高,达到97.1%。从N蛋白aa序列看,分离株之间除HT-P、THD1与HD aa序列同源性较高（99.0%以上）外,其他分离株之间aa同源性低。而Clan与Onderstepoort有着很高的同源性关系,同源性比例达97.3%.本研究结果提示,HD和LN发病区域相距较远,但具有较高的同源性,而与HB具有相对较低的nt同源性,提示野毒株在易感动物上可能存在种属差异。此外,分离毒株H和N蛋白免疫原性可能与疫苗株有较大差别,可能与CD免疫失败有关。4.犬瘟热病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的研究:按照CDV N基因序列,设计合成了特异性引物和探针,经各反应条件的优化,建立了CDV的Real-time荧光定量RT-PCR检测技术。用20pmol/mL的引物浓度各1uL和20pmol/mL的探针浓度0.3uL,获得的荧光信号最强,曲线平滑。敏感度为1.24×10-3ng/mL的病毒RNA;与NDV、AIV、NiPV等RNA病毒不发生交叉反应。试验重复性的变异系数（CV）分别为2.3%、2.5%和4.2%。对采集的57份临床样品进行检测,荧光RT-PCR检测阳性检出率为93%（53/57）,而BIOINDIST BIT RAPID CDV试剂盒、常规RT-PCR阳性检出率分别为70.2%（40/57）和71.9%（41/57）,与BIOINDIST试剂盒和常规RT-PCR的符合率分别为77.2%和78.9%,而BIOINDIST试剂盒与常规RT-PCR符合率达98.2%。结果表明,本研究建立的检测CDV的荧光RT-PCR方法具有快速、特异、敏感、可定量,并可同时检测大量样品等优点,能用于CDV感染的早期诊断和海关检疫。5.貉源犬瘟热病毒H、F和N基因真核表达质粒的构建与鉴定:将貉源CDV分离株的H、F和N（N1,N2）基因经RT-PCR扩增后,连接到pMD18-T载体,对比测序结果表明各基因序列正确,并且符合阅读框规则。然后将各基因亚克隆到真核表达载体pIRES1neo中,经PCR方法和限制酶酶切鉴定成功构建了四种重组真核表达质粒,分别命名为pIRES T-N1、pIREs T-N2、pIREs T-H、pIRES T-F。用构建的真核重组质粒转染VERO-DST细胞,用抗CDV阳性血清进行Western blot分析,结果表明,各重组质粒可以表达相应的目的蛋白。6.貉源犬瘟热病毒H、F和N基因表达质粒DNA免疫保护效率研究本研究将pIRES T-H、pIRES T-F、pIRES T-N1和pIRES T-N2四个真核表达质粒作为基因疫苗,单独或混合分组对42只小鼠和21只断奶貉进行了动物免疫试验,对免疫的实验貉进行了攻毒保护实验,并与chn弱毒疫苗、进口CDV-CPV二联疫苗进行了比较。结果为:（1）小鼠免疫试验采用构建的基因疫苗免疫小鼠2次后开始有抗体反应,免疫第3次后小鼠血清中抗CDV ELISA抗体和中和抗体水平与免疫前和空载体阴性对照相比明显增高（p＜0.05）。从ELISA抗体滴度比较,四种基因疫苗联合免疫组（简称“四基因组”）与pIRES T-H组、pIRES T-F组和pIRES T-N1+pIRES T-N2组差异不显著,但其中和抗体水平明显高于单一基因疫苗组（p＜0.05）。chn组中和效价与四基因组差异不显著,但ELISA滴度明显高于四基因组。CDV-CPV组ELISA抗体滴度和中和抗体滴度均明显高于各基因疫苗组（p＜0.05）。（2）貉免疫保护试验基因疫苗免疫貉后,血清中CDV ELISA抗体滴度(OD650值)组间差异不显著,但是四基因组比单独免疫组有较高抗体滴度。4种基因疫苗经3次免疫貉后,四基因组与其他3组相比中和滴度较高。四基因组与chn组、CDV-CPV组免疫后都有抗体升高,但是chn组上升较低,CDV-CPV组上升较高。CDV-CPV组中和抗体水平明显高于四基因组2个滴度。攻毒实验表明,除四基因组外,pIRES T-H、pIRES T-F、pIRES T-N1+pIRES T-N2组各有不同程度死亡。Chn组死亡1只,而CDV-PPV组均存活。比较存活貉的临床表现,基因疫苗免疫的四个组在攻毒后反应程度不一,四基因组均存活,分值分别为10、9、2;pIRES T-N1+pIRES T-N2组反应严重,存活貉分值:12,另2只死亡;pIRES T-H组存活的2只貉中1只垂危（分值:13）,另1只表现较严重的症状（分值:8）;pIRES T-F组存活的唯一貉也表现神经症状（分值:12）。与基因疫苗免疫组相比,CDV-CPV组、chn组在攻毒后反应相对轻微,但是chn组仍有死亡现象发生。与CDV-CPV组存活的3只貉相比,四基因组虽然都存活,但是有2只出现相对比较严重的临床症状（分值:10,9）,而CDV-CPV组只有1只有上述表现（分值:8）,另2只除短暂体温升高外,没有异常表现。剖检结果可以看出,免疫组自然死亡貉中,pIRES T-H组、pIRES T-F组和pIREST-N1+pIRES T-N2组表现中度至严重病理变化,而chn组死亡1只貉病变程度相对较低。试验结束实施安乐死的貉均呈轻微至中度变化。排毒检测结果表明,试验貉中除了CDV-PPV组的2只和四基因组中的1只一直没有检测到CDV特异核酸外,其他样品都在不同采样时段或采集的不同样品中检测到。其中血液中检出时间最早,其次为眼结膜、直肠拭子。眼结膜拭子的检出率和检出时间较直肠拭子的高,检出时间较早。自然死亡貉组织都扩增出了CDV特异性目的片段。从症状和病变看,空白对照组明显比免疫组严重,四基因联合免疫组比单基因免疫组轻微,与CDV-CPV组和chn组差别不大。四基因组的保护效果明显优于单基因免疫组,虽然仍能通过眼睛、肛门等天然孔途径向外界排毒,但能抵抗CDV强毒株的感染。本研究结果表明,采用混合H、F和N基因疫苗免疫貉可以诱导机体产生较好的体液免疫反应和较好的免疫保护作用,为毛皮动物用CDV新型疫苗研究奠定了重要基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略语
• 第一篇 文献综述
• 犬瘟热病毒研究进展
• 1 病原特性
• 1.1 CDV基因组RNA
• 1.2 病毒结构蛋白
• 1.3 CDV生物学特性
• 2 诊断技术
• 2.1 病毒分离与鉴定
• 2.2 包涵体检查法
• 2.3 离子捕获电镜检查法
• 2.4 组织学检查
• 2.5 免疫学检测
• 2.6 分子生物学诊断技术
• 2.7 展望
• 3 CDV免疫学
• 3.1 体液免疫
• 3.2 细胞免疫
• 3.3 免疫调节机制的研究
• 3.4 免疫抑制
• 4 犬瘟热疫苗
• 4.1 甲醛灭活疫苗
• 4.2 细胞培养弱毒疫苗
• 4.3 基因工程疫苗
• 4.4 展望
• 5 CDV与人类疾病
• 参考文献
• 第二篇 实验研究
• 第一章 貂、狐、貉群犬瘟热临床病理学研究
• 1 材料与方法
• 1.1 病例来源
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要设备
• 1.4 实验设计
• 2 结果
• 2.1 流行病学调查
• 2.2 临床症状
• 2.3 剖检变化
• 2.4 病理组织学观察
• 3 讨论
• 参考文献
• 第二章 貂、狐、貉源犬瘟热病毒的分离鉴定与生物学特性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 细胞及主要试剂
• 1.2 参考毒株
• 1.3 红细胞
• 1.4 试验动物
• 1.5 病料及病料处理
• 1.6 引物设计与合成
• 1.7 病毒分离
• 1.8 病毒粒子形态观察
• 1.9 清洁级小白乳鼠脑内接种感染实验
• 1.10 RT-PCR鉴定
• 1.11 红细胞凝集谱试验
• 50测定'>1.12 病毒TCID₅₀测定
• 1.13 理化特性鉴定
• 50)测定'>1.14 乳鼠半数致死量(LD₅₀)测定
• 1.15 对实验兔感染实验
• 1.16 对貉的致病力实验
• 2 结果
• 2.1 细胞病变观察
• 2.2 电镜观察
• 2.3 RT-PCR扩增
• 2.4 红细胞凝集谱
• 50测定'>2.5 TCID₅₀测定
• 2.6 理化特性鉴定
• 50)测定'>2.7 清洁级乳鼠脑内接种试验与乳鼠半数致死量(LD₅₀)测定
• 2.8 实验兔感染实验
• 2.9 对貉的致病力实验
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三章 貂、狐、貉源犬瘟热病毒分离株H和N基因序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 菌种、质粒
• 1.2 毒株、细胞
• 1.3 主要试剂、设备
• 1.4 引物的设计与合成
• 1.5 病毒的增殖
• 1.6 总RNA提取与RT-PCR扩增
• 1.7 目的基因的克隆与鉴定
• 1.8 目的基因的核苷酸序列测定与系统发育进化树分析
• 1.9 引用的毒株核酸序列GENEBANK号
• 2 结果
• 2.1 CDV毒株H基因克隆和鉴定
• 2.2 CDV毒株N基因克隆和鉴定
• 2.3 H基因核苷酸及其推导的氨基酸序列同源性比较
• 2.4 CDV毒株H基因系统进化树
• 2.5 各毒株N基因的核苷酸及其推导的氨基酸序列同源性比较
• 2.6 CDV毒株N基因系统进化树
• 3 讨论
• 参考文献
• 第四章 犬瘟热病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的研究
• 1 材料
• 1.1 病毒株、细胞
• 1.2 被检样品
• 1.3 实验动物
• 1.4 主要试剂和设备
• 2 方法
• 2.1 病毒培养
• 2.2 样品的准备
• 2.3 病毒RNA的提取
• 2.4 引物和探针设计
• 2.5 TAQMAN REAL-TIME荧光RT-PCR方法的建立
• 2.6 定量用标准品的制备
• 2.7 特异性试验
• 2.8 敏感性试验
• 2.9 重复性试验
• 2.10 常规RT-PCR
• 2.11 BIOINDIST试剂盒检测
• 2.12 三种方法检测临床样品的比较
• 3 结果
• 3.1 反应体系的优化
• 3.2 TAQMAN RT-PCR重复性
• 3.3 特异性
• 3.4 敏感性
• 3.5 TAQMAN RT-PCR与其它检测方法比较
• 4 讨论
• 参考文献
• 第五章 貉源犬瘟热病毒H、F和N基因真核表达质粒的构建与鉴定
• 1 材料
• 1.1 毒株与细胞
• 1.2 菌株、质粒和载体
• 1.3 主要试剂
• 1.4 兔抗CDV阳性血清
• 2 方法
• 2.1 病毒培养
• 2.2 病毒基因组总RNA的提取
• 2.3 RT-PCR
• 2.4 PCR产物的纯化与回收
• 2.5 CDVF、H、N1和N2重组T载体的克隆与测序
• 2.6 H、F、N1和N2基因重组真核表达质粒的构建
• 2.7 重组真核表达质粒的表达与鉴定
• 3 结果
• 3.1 H、F和N蛋白免疫原基因的扩增与鉴定结果
• 3.2 因免疫质粒的构建与鉴定
• 3.3 WESTERN BLOT分析重组真核质粒的表达
• 4 讨论
• 参考文献
• 第六章 貉源犬瘟热病毒H、F和N基因表达质粒DNA免疫保护效率研究
• 1 材料与方法
• 1.1 质粒、疫苗、毒株及细胞
• 1.2 实验动物
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要设备
• 1.5 小鼠免疫试验
• 1.6 貉免疫保护试验
• 1.7 统计学分析
• 2 结果
• 2.1 小鼠免疫试验结果
• 2.2 貉免疫保护试验
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 致谢
• 发表文章