副猪嗜血杆菌的分离鉴定及其在模拟体内发病条件下培养的蛋白组学研究

论文摘要

副猪嗜血杆菌（?Haemophilus parasuis,HPS）属巴氏杆菌科嗜血杆菌属成员,为革兰阴性、小短杆至长丝状、V因子依赖性、非溶血性细菌,是猪上呼吸道的一种常在菌,在一定条件下可引起严重的全身性疾病,以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为主要特征,该病原引起的疾病称为革拉氏病（Glasser’s disease）。该菌多与其他病原如猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒等混合感染,严重危害了仔猪和青年猪的健康。近年来由于该病的频繁发生,给养猪业带来了严重的损失,因此倍受人们的关注。副猪嗜血杆菌致病机制复杂,毒力因子尚不清楚。因此,探寻致病机理和寻找毒力因子显得尤为重要。本文从上海地区收集样品分离鉴定副猪嗜血杆菌,通过研究正常和模拟发病条件培养副猪嗜血杆菌蛋白质组表达的差异,并用质谱鉴定相关差异蛋白质,以期为寻找新的毒力因子提供线索,为研制新型亚单位疫苗奠定基础。1.2008年2月至2011年4月,从上海市动物疫病预防控制中心门诊、上海地区规模化养殖杨、屠宰场的4124份样品中,结合临床表现、病理变化及实验室HPS的培养特性及形态、染色情况等对其进行了初步鉴定,分离了102株副猪嗜血杆菌疑似株。根据HPS 16S rRNA基因设计合成引物建立特异PCR,并结合生化试验结果,从102份样品中鉴定出61株HPS。HPS总分离率为1.48%（61/4124）,其中来自上海市动物疫病预防控制中心门诊采集的临床样品,占70.5%,其余为猪场日常监测的咽喉拭子及屠宰场心、肺等样品。对61株HPS进行药敏试验,结果表明所有分离株对头孢类和喹诺酮类药物较为敏感,但对新生霉素、阿米卡星、林可霉素、红霉素和庆大霉素等对多种抗生素产生了严重的耐药性。血清学分型显示分离株以血清5型最为流行,所占比例分别为34.4%,其次为血清2、4、13和14型,其中11株分离株不能进行分型。2.根据已有研究,改变细菌的培养条件可以用来模拟细菌在宿主体内的生长情况,从而使细菌的相关毒力因子进行表达。以临床上分离的血清5型副猪嗜血杆菌为材料,通过改变副猪嗜血杆菌的培养条件,以此模拟在发病猪体内该菌的生长环境,然后提取正常体外培养条件和模拟发病猪体环境进行培养的副猪嗜血杆菌的总蛋白,分别进行3次双向电泳,利用双向电泳结果和软件分析建立了三组蛋白双向电泳图谱。在pH4-7凝胶图谱上,经ImageMaster v6.01程序软件分析和初步筛选显示43个蛋白点的表达存在明显差异（蛋白质差异表达量在1.5倍以上）,其中蛋白差异表达量在3倍以上15个,有6个蛋白点为副猪嗜血杆菌在模拟发病猪体环境进行培养后新出现的蛋白。3.分析两种不同培养条件下副猪嗜血杆菌蛋白表达的差异,对差异表达量在3倍以上的蛋白点和表达完全差异蛋白点共21个进行胶内酶切,用激光解析电离串联飞行时间质谱MALDI-TOF/TOF-MS鉴定相关差异蛋白质,最终成功检测出蛋白10种,包括硫酸腺苷酰转移酶、丙酮酸脱氢酶、琥珀酰COA合成酶、外膜蛋白、翻译延长因子TU、尿素酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、TRWC、3-氧酰基还原酶、细菌磷酸转移酶系统。本结果为寻找HPS新的毒力因子,进而研究该菌致病机制提供了理论依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 第一篇 文献综述
• 第一章 副猪嗜血杆菌的研究进展
• 1 病原学
• 2 临床与病理学特征
• 3 流行病学
• 4 毒力因子研究进展
• 4.1 菌毛
• 4.2 荚膜
• 4.3 脂多糖（LPS）
• 4.4 外膜蛋白（OMP）
• 4.5 转铁结合蛋白（TBP）
• 4.6 神经氨酸酶（NA）
• 4.7 生物被膜（BF）
• 4.8 其它
• 5 诊断方法研究进展
• 5.1 清学诊断
• 5.2 免疫组化法诊断
• 5.3 分子生物学诊断
• 6 预防与治疗研究进展
• 6.1 非免疫接种保护
• 6.2 免疫接种保护
• 6.3 药物预防与治疗
• 7 总结与展望
• 参考文献
• 第二章 双向电泳及质谱分析研究进展
• 1 双向电泳技术
• 1.1 双向电泳的研究历史
• 1.2 双向电泳技术的原理
• 1.3 样本制备
• 1.4 蛋白等电聚焦电泳
• 1.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 1.6 双向电泳的显影及鉴定
• 1.7 双向电泳技术在病原微生物蛋白质组研究中的进展
• 1.8 双向电泳的缺陷
• 1.9 前景与展望
• 2 质谱分析
• 2.1 质谱用于细菌检测及鉴定的发展历史
• 2.2 质谱分析的基本原理
• 2.3 质谱分析种类
• 2.4 生物质谱在医学领域的应用
• 2.5 展望
• 参考文献
• 第二篇 试验研究
• 第三章 副猪嗜血杆菌的分离鉴定及其生物学特性分析
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 分离菌株的形态学特性
• 2.2 分离菌株的培养特性
• 2.3 PCR检测
• 2.4 分离菌株的生化特性鉴定
• 2.5 药敏试验
• 2.6 分离菌株的血清型分析
• 3 讨论
• 参考文献
• 第四章 正常和模拟发病条件培养的副猪嗜血杆菌蛋白表达差异分析
• 1 材料和方法
• 1.1 培养基与菌株
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 主要溶液配方
• 1.5 试验方法
• 2 结果
• 2.1 利用pH3-10的IPG干胶条进行双向电泳的预试验
• 2.2 利用pH4-7的IPG干胶条进行双向电泳的正式试验
• 3 讨论
• 3.1 菌株的培养
• 3.2 双向电泳
• 参考文献
• 第五章 差异蛋白的质谱分析
• 1 材料与方法
• 1.1 试验样品
• 1.2 主要化学试剂及仪器设备
• 1.3 样品酶解
• 1.4 肤混合物的质谱检测
• 2 结果及分析
• 2.1 差异表达蛋白质斑点选取
• 2.2 质谱鉴定
• 3 讨论
• 3.1 副猪嗜血杆菌蛋白质研究方法
• 3.2 质谱分析
• 参考文献
• 全文总结
• 致谢