论文摘要
【研究背景与目的】mda-7是由Jiang等应用增生活跃和诱导终末分化的人类HO-1黑素瘤细胞产生的cDNA文库进行减数杂交时获得的,并初步证明mda-7具有抑制黑素瘤增生和促进终术分化的能力。之后mda-7一直作为肿瘤抑制物被研究,直到2001年,Huang等发现mda-7的染色体定位、基因结构以及随后Caudell等用一系列实验证实了mda-7的细胞因子属性,从而被命名为白细胞介素-24（IL-24）,归属于IL-10家族。一系列研究表明腺病毒介导的mda-7/IL-24（Ad.mda-7）选择性诱导不同类型的肿瘤细胞凋亡,而对正常细胞无明显毒性。多种肿瘤异种移植动物模型研究显示,Ad.mda-7可抑制体内肿瘤形成和进展,甚至具有抗血管生成活性和放疗增敏等作用。目前在美国,Ad.mda-7已进入Ⅱ期临床试验,在人体内重现了前临床试验观察到的抗肿瘤效应。然而,mda-7/IL-24选择性诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制较为复杂,不同类型的肿瘤细胞可能涉及不同的调控通路,如Ad.mda-7通过fas-fasL信号通路诱导卵巢癌细胞凋亡;通过p38MAPK通路诱导黑素瘤细胞凋亡:通过PKR通路诱导肺癌细胞凋亡等。还有研究表明,胞内的mda-7/IL-24定位于内质网和高尔基体复合物,并且胞内mda-7/IL-24诱导凋亡的机制可能涉及到内质网的信号转导通路。肝细胞癌（HCC）是世界上病死率最高的五大肿瘤之一,并且其发病率有增加的趋势。关于mda-7/IL-24诱导肝癌细胞凋亡的研究迄今鲜见报道。为此,近年来我们实验室开展了mda-7/IL-24诱导肝癌细胞生长抑制和凋亡及其机制的系列研究。本论文着重进行腺病毒介导mda-7/IL-24诱导肝癌细胞凋亡的体内外实验研究,探讨其与内质网应激通路的分子机制。[研究方法]1.重组腺病毒Ad.mda-7的构建、制备、包装、扩增和纯化:采用目前常用的AdEasyTM Adenoviral Vector System构建携带人IL-24 cDNA的重组腺病毒质粒pAd.mda-7,转染293细胞后,通过筛选、包装、扩增和纯化,获得重组腺病毒载体Ad.mda-7。同时构建空腺病毒载体携带绿色荧光蛋白（GFP）的重组腺病毒Ad.GFP用作实验对照。（由本院分子肿瘤实验室保存提供）2.Ad.mda-7诱导肝癌细胞生长抑制和凋亡的实验:以MOI值为10的Ad.mda-7和Ad.GFP分别处理人肝癌细胞株Hep3B（p53突变型）、HepG2（p53野生型）、PLC/PRF/5（p53突变型）和正常人肝细胞株L02（p53野生型）,应用四氮唑蓝（MTT）细胞活力试验测定受试细胞的生长变化,应用DNA片段化分析和流式细胞仪等技术检测受试细胞的凋亡情况,并通过western blot检测其调控机制,并对实验数据进行统计学处理。3.Ad.mda-7治疗荷瘤裸鼠模型的实验:将体外培养的人肝癌细胞HepG2接种至裸小鼠背部皮下,建立肝癌裸鼠模型。采用瘤内单点注射的方法分别给予Ad.GFP、Ad.mda-7和ALLN+Ad.mda-7,观察瘤质量和瘤体积的变化,以及通过免疫组化和TUNEL法检测肿瘤组织内凋亡相关蛋白活化caspase-3、凋亡细胞率、细胞增殖相关抗原ki-67和微血管密度,并通过western blot初步探讨可能涉及的凋亡作用机制,并对实验数据进行统计学处理。[实验结果]1.Ad.mda-7抑制肝癌细胞生长,而对正常肝细胞无作用在开始实验前,测定肝癌细胞系和正常肝细胞转染病毒效率＞70%。肝癌细胞系和正常肝细胞L02感染Ad.mda-7或Ad.GFP（MOI=0.01-1000）,MTT法检测各细胞存活率,以未处理的细胞作为参照。结果显示正常肝细胞L02感染Ad.mda-7或Ad.GFP,无明显抑制增殖作用（P＞0.05）。而各种肝癌细胞系感染Ad.mda-7与感染Ad.GFP比较,明显抑制生长（P＜0.05）。这些研究证明了Ad.mda-7选择性抑制肝癌细胞的增殖和生长作用,而对正常肝细胞无明显毒副作用。接下来探讨了Ad.mda-7选择性抑制肝癌细胞生长的机制。我们通过流式细胞仪观察到Ad.mda-7诱导肝癌细胞系的凋亡。肝癌细胞系感染Ad.mda-7与感染Ad.GFP比较,明显高凋亡率（P＜0.001）;而正常肝细胞L02感染Ad.mda-7或Ad.GFP没有明显改变,凋亡率分别为15.07%和13.65%（P＞0.05）。在三种肝癌细胞系中,当MOI=10时,约有66%的HepG2（p53野生型）细胞生长受抑制,约47%细胞凋亡,其生长抑制和凋亡现象最为显著。另两种肝癌细胞系Hep3B（p53缺失型）和PLC/PRF/5（p53突变型）也明显生长抑制和凋亡。这些数据说明mda-7/IL-24通过非p53途径选择性诱导肝癌细胞凋亡。2.Ad.mda-7激活内质网应激通路诱导肝癌细胞凋亡选择对Ad.mda-7作用最为敏感的HepG2肝癌细胞进一步研究其诱导凋亡的机制。先前的研究发现胞内的mda-7/IL-24定位于内质网和高尔基体复合物,并且mda-7/IL-24通过其C和F环与BiP/GRP78蛋白偶联。Western blot检测到HepG2细胞感染Ad.mda-7后,高表达BiP/GRP78,同样阳性对照毒胡萝卜素（TG）也高表达BiP/GRP78,但阴性对照组PBS和Ad.GFP未检测到表达。接下来,我们检测了另一个内质网应激相关蛋白caspase-12,结果感染Ad.mda-7和阳性对照TG的HepG2细胞,caspase-12（57 kDa）活化降解（48 kDa）,而阴性对照组caspase-12还是酶原形式。相反,Ad.mda-7感染正常肝细胞L02未能激活BiP/GRP78和caspase-12。看家基因β-actin在各处理的细胞中表达未有变化。总之,内质网应激,激活BiP/GRP78,引起caspase-12降解,最后导致细胞凋亡。这些结果说明Ad.mda-7可能通过激活caspase-12的内质网应激通路诱导肝癌细胞凋亡。3.Ad.mda-7诱导肝癌细胞凋亡,上调Bax、easpase-3和p38 MAPK表达研究表明通过死亡受体通路（外在通路）和线粒体通路（内在通路）激活caspase引起细胞凋亡。Bax和其他Bcl-2家族成员在线粒体通路中发挥着重要作用,caspase-3是线粒体凋亡通路的主要caspase效应分子。而外在通路由死亡受体介导,并且caspase-8是其主要的caspase启动分子。在我们的实验中,Ad.mda-7感染HepG2细胞48 h后,激活Bax;同样caspase-3从酶原形式（32k Da）降解到17 kDa;而caspase-8仍是酶原形式。并且,我们观察到p38 MAPK的磷酸化。对照组PBS和Ad.GFP各蛋白没变化。看家基因β-actin在各处理的细胞中表达未有变化。这些结果说明,Ad.mda-7通过非死亡受体通路诱导肝癌细胞凋亡,并且上调Bax、caspase-3的表达和p38 MAPK的磷酸化。4.阻断内质网应激,抑制了Ad.mda-7诱导的肝癌细胞凋亡我们用钙蛋白酶抑制剂Ⅰ（ALLN）阻断内质网应激通路,观察对感染Ad.mda-7的HepG2细胞的生长是否有影响。钙蛋白酶不直接参与内质网应激,但它可激活下游的caspase-12引起细胞凋亡。而ALLN可阻断caspase-12引起的内质网应激反应。ALLN可抑制Ad.mda-7诱导的多种肿瘤细胞凋亡作用,剂量依赖实验显示25μM的ALLN对HepG2无明显毒副作用。MTT法检测结果显示,经过ALLN处理30 min后感染Ad.mda-7（ALLN+Ad.mda-7）的HepG2细胞,3d后细胞存活率约75%,而未经过ALLN处理感染Ad.mda-7的HepG2细胞存活率约40%（P＜0.05）。而对照组经或未经ALLN处理感染Ad.GFP的HepG2细胞存活率约为86%、83%,与ALLN+Ad.mda-7三组间无统计学意义（P＞0.05）。一系列实验证实ALLN可以明显抑制Ad.mda-7诱导的肝癌细胞凋亡作用。经过ALLN处理感染Ad.mda-7的HepG2细胞与未经过ALLN处理感染Ad.mda-7的HepG2细胞比较,3 d后前者未见明显DNA梯度,而后者DNA梯度明显。同样,流式细胞仪分析结果表明:未经过ALLN处理感染Ad.mda-7的HepG2细胞凋亡约44%,而经ALLN处理过的只有约28%的细胞出现凋亡（P＜0.05）。而对照组经或未经ALLN处理感染Ad.GFP的HepG2细胞凋亡约13%和11.5%,未感染病毒的对照HepG2细胞约有9%出现凋亡,三组间无统计学意义（P＞0.05）。这些结果说明Ad.mda-7可通过激活内质网应激通路诱导肝癌细胞凋亡,而这一作用可被ALLN抑制。5.抑制内质网应激通路,Ad.mda-7下调肝癌细胞caspase-3、-12和Bax表达Western blot进一步检测是否caspase-12在Ad.mda-7介导的内质网应激凋亡通路中起着重要作用。经过ALLN处理后感染Ad.mda-7的HepG2细胞与未经ALLN处理感染Ad.mda-7的HepG2细胞比较,caspase-12活化显著受到抑制;同样Bax和caspase-3的活化明显下降。这说明Ad.mda-7通过激活caspase-12,然后引起Bax和caspase-3的激活而诱导HepG2细胞凋亡。然而BiP/GRP78经或不经ALLN处理表达未见改变;并且p38MAPK的磷酸化并没因为ALLN的处理而变化。而对照组Ad.GFP或ALLN+Ad.GFP各蛋白未见改变,并且看家基因β-actin在各处理的细胞中表达未有变化。所以,这些结果表明Ad.mda-7通过包括caspase-12在内的内质网应激通路诱导肝癌细胞凋亡,并且与线粒体通路有着密切关联。6.在体内,Ad.mda-7抑制肝癌的生长、增殖和抗血管形成然后,我们探讨是否Ad.mda-7在体内有抑制肝癌生长的作用。皮下接种HepG2细胞后5 d可在接种部位扪及大小约3 mm的皮下结节,待肿块长至直径4-5mm时进行治疗试验。全部裸鼠均接种成功,治疗期间无死亡。通过瘤内注射给予病毒后,观察到Ad.mda-7治疗组大多数肿瘤比Ad.GFP对照组肿瘤生长速度缓慢,3 w后取出完整肿块,计算肿瘤体积和称重。Ad.mda-7治疗组和Ad.GFP对照组的肿瘤体积分别为312.6±30.24 mm3和520.6±30.00 mm3（P=0.001）,两组的肿瘤质量分别为0.321±0.031 g和0.534±0.030 g（P=0.001）,两者间具有统计学显著性差别。细胞增殖相关抗原ki-67是目前被广泛采用的细胞增殖相关标记物之一。在Ad.GFP处理的肿瘤组织内,大多数肿瘤细胞呈阳性,说明肿瘤细胞增殖活跃。而在Ad.mda-7处理的肿瘤组织内,ki-67阳性细胞明显减少,细胞增殖受到抑制。Ad.mda-7实验组和Ad.GFP对照组的肿瘤细胞增殖指数（PI）分别为26.67±4.56%和57.14±5.56%（P=0.002）。并且,CD31因子是新生血管的标记物之一,其抗体常被用来检测微血管密度（MVD）。经Ad.mda-7处理的肝癌组织内新生血管化明显低于Ad.GFP对照组,两组的MVD分别为19.59±2.50%和32.27±4.52%（P=0.013）。这些数据表明了Ad.mda-7在体内具有抑制肝癌的生长和增殖,并有抗肿瘤血管形成的作用。7.在体内,Ad.mda-7诱导肝癌组织细胞凋亡肿瘤组织常规HE染色,在裸鼠皮下接种形成的肿瘤组织中可见大量纤维间隔形成,肿瘤细胞核大深染,分裂像不规则;Ad.mda-7处理后肿瘤细胞形态不同于Ad.GFP处理,细胞核浓缩明显。TUNEL法是在TdT酶作用下,将生物素或溴标记的核苷酸杂交到细胞内断裂的DNA游离的3’OH上,然后加入酶或荧光素标记的亲和素或者标记核苷酸抗体,达到原位检测的目的。Ad.mda-7处理后肝癌细胞的凋亡数量显著增多,凋亡率明显高于Ad.GFP对照组,具有统计学差异（P＜0.05）。并且,我们观察到在Ad.mda-7处理的肿瘤组织caspase-3大量活化,但Ad.GFP处理的肿瘤组织只有少量着色。这说明Ad.mda-7可通过激活caspase-3诱导体内肝癌组织细胞凋亡。接下来,我们在荷瘤裸鼠腹腔内注射ALLN,当ALLN剂量为100mg/kg,对荷瘤裸鼠的生长无影响,无毒副作用。然而,当ALLN+Ad.mda-7治疗组与Ad.mda-7对照组比较,TUNEL法检测裸鼠肝癌的凋亡率明显减少（P＜0.05）。这表明ALLN在体内有抑制Ad.mda-7诱导肝癌细胞凋亡的作用。进一步,Western blot观察到在体内ALLN+Ad.mda-7治疗组的caspase-12、-3和Bax蛋白与Ad.mda-7对照组比较,表达都有所减少。这些结果说明,激活caspase-12的内质网应激通路在体内Ad.mda-7诱导肝癌细胞凋亡起着重要作用。[结论]1.Ad.mda-7可选择性诱导体外培养的人肝癌细胞株生长抑制。2.Ad.mda-7可选择性诱导体外培养的人肝癌细胞株凋亡,而对正常肝细胞无作用。3.Ad.mda-7可通过内质网应激通路诱导肝癌细胞生长抑制和凋亡;并可上调Bax、caspase-3和p38 MAPK表达。4.Ad.mda-7可抑制荷瘤裸鼠肝癌的生长、增殖和抗血管形成。5.Ad.mda-7诱导荷瘤裸鼠肝癌组织细胞凋亡可能通过内质网应激通路。总之,本论文以人肝癌细胞株为实验模型,应用多种方法研究了Ad.mda-7在体内外选择性诱导肝癌细胞生长抑制和凋亡的活性,并探讨了Ad.mda-7治疗肝癌可能涉及内质网应激凋亡通路的作用机制,进一步验证了IL-24的广谱抗肿瘤作用,为Ad.mda-7用于临床肝癌治疗积累了实验资料。
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