论文摘要
第一部分过度活跃膀胱中不稳定收缩的神经肌电研究背景和目的:过度活跃膀胱（overactive bladder;OAB）中最主要诊断依据是临床症状尿急或尿动力学检查有充盈期的逼尿肌不稳定收缩。在临床上不管有没有尿动力学证据,在除外尿路感染等明确因素的情况下,尿急症状可以成为OAB的诊断的首要依据。OAB患者尿急的感觉首先考虑有来自膀胱经盆神经向中枢的传入信号;再次不稳定收缩时,膀胱压力的期相性升高可能和支配膀胱的副交感神经（亦走行在盆神经内）的传出信号有关。即便有证据说明这种不稳定收缩的起源系由膀胱局部因素引发产生,甚至并不依赖于盆神经传递信号,但在其不稳定收缩时膀胱的感觉传入神经也可能会将压力上升的感觉信号传入中枢,而这恰恰可能和OAB患者的尿急症状密切相关。但是尿急的依据往往只是来自病人的主观感觉,客观上OAB膀胱不稳定收缩时控制膀胱感觉和收缩的盆神经传入、传出纤维是否存在确切的神经信号及其它相关神经肌电的生理反应仍然没有明确。基于此,本部分研究在建立大鼠膀胱出口梗阻（bladder outlet obstruction;BOO）后的OAB模型基础上,着手考察在膀胱充盈期（储尿期）不稳定收缩时,有没有支配膀胱收缩的副交感神经随不稳定收缩而改变的传出信号出现,如果有记录到明显相关的从中枢来的传出兴奋信号,则说明这种不稳定收缩波有来自中枢信号的参与。另一方面,从膀胱感觉角度（传入神经纤维）考察,如果在不稳定收缩时记录到膀胱感觉神经的传入信号随膀胱压力增强,则可说明不稳定收缩时有传入信号进入中枢,并且这可能是病人引发尿急症状的原因,从而说明膀胱不稳定收缩是有其存在的神经因素,并且此传入信号和临床尿急症状密切。材料和方法:1.建立BOO大鼠,梗阻方法包括经耻骨上膀胱颈梗阻、经会阴尿道梗阻、和经闭孔耻骨后中段尿道梗阻。2.充盈性膀胱测压检查确定BOO大鼠6-8周后是否存在充盈期不稳定收缩,按ICS的传统标准大于15 cmH2O的不稳定收缩确定OAB大鼠。3.乌拉坦麻醉OAB大鼠,分别在膀胱充盈测压（模式A）和膀胱颈结扎等容（0.8 ml;模式B）下,进行显微手术暴露盆神经、阴部神经运动支、尿道外括约肌等盆会阴结构,进行同步化神经、肌电生理记录,测定不稳定收缩时盆神经传入（夹伤盆神经记录点的周围端）电位信号或传出（夹伤记录点的中枢端）电位信号,并同步测定阴部神经运动支电位、尿道外括约肌肌电及腹肌肌电的反射反应。对各神经电位和肌电图进行不稳定收缩前和不稳定收缩时的放电频率和幅度量化统计和比较。4.分别对T8胸段脊髓中枢及控制膀胱的周围神经进行截断损伤,观察OAB大鼠在膀胱充盈测压（模式A）和等容（模式B）两种情况下不稳定收缩的前后改变,具体截断包括T8段脊髓截断、双侧盆神经截断、腹交感干截断、和双侧阴部神经截断。统计并比较膀胱基础压、不稳定收缩压在截断前后的变化和差异。5.进行OAB大鼠逼尿肌离体肌条实验,在OAB离体逼尿肌条纪录实验中,为使得离体逼尿肌从去中枢控制状态到完全去神经影响的状态,引入一种含有多种神经受体阻滞剂的Cocktail混合液。摘取OAB大鼠膀胱,分离获得离体平滑细肌条,进行一定初张力下的等长收缩实验和电刺激试验,纪录在含有Cocktail混合液干预前后的37°C生理液孵浴下,OAB离体逼尿肌的电刺激收缩反应和肌条自发兴奋收缩变化特征,分别比较这两种收缩的幅度和频率在Cocktail干预前后差异。结果:1.三种不同的方法形成的BOO状态在经充盈测压后确定的OAB大鼠在膀胱重量及尿动力学相关指标比较之间均无明显差异,但和正常大鼠均有显著差异。2.膀胱充盈测压下（模式A）的同步神经肌电生理记录,依据不稳定收缩前和不稳定收缩时盆神经传入、传出及相关神经肌电反应电位频率或幅度是否存在显著变化,不稳定收缩可观察到两种类型,分别为收缩较大的B-Poab和较小的S-Poab。前者同步盆神经传入、传出的信号统计增加显著,并且能引发阴部神经、尿道外括约肌电图和腹肌肌电图反应的显著变化。而S-Poab则均没有上述盆神经传入、传出及相关神经神经肌电反应变化。3.膀胱等容测压情况下（模式B）的同步神经肌电生理记录,发现膀胱基础压力升高,但同样出现和前面充盈测压模式A相似的充盈-排尿周期相似的排尿样收缩周期,在排尿样收缩的间期,也出现不稳定收缩。并且同样依据上述同步化神经肌电生理记录反应的不同,不稳定收缩分为有盆神经传入、传出信号变化和相关神经肌电生理反射的B-Poab和均没有神经肌电变化和反射的S-Poab。4.脊髓中枢截断后对OAB大鼠不稳定收缩影响的结果:T8脊髓截断后,在充盈测压情况下（模式A）,膀胱失去充盈-排尿收缩周期,膀胱基础压显著升高,其中B-Poab不稳定收缩消失,S-Poab仍然存在,并且幅度比截断前稍有上升,但无显著差异。在膀胱等容测压下（模式B）,T8脊髓截断后膀胱失去排尿样收缩周期,膀胱基础压显著升高,B-Poab消失,S-Poab幅度稍有上升,但和损伤前无显著差异。5.膀胱周围神经逐步截断后对OAB大鼠不稳定收缩影响的结果:膀胱的外周神经逐步截断依盆神经、交感神经、和阴部神经的次序,在充盈测压下（模式A）,膀胱失去充盈-排尿收缩周期,膀胱基础压显著升高,不稳定收缩中B-Poab消失,S-Poab保留且前后无显著差异。在阴部神经损伤时还观察到膀胱基础压显著下降。在膀胱等容测压下（模式B）,膀胱失去排尿样收缩周期,基础膀胱压同样显著升高,B-Poab不稳定收缩消失,S-Poab不稳定收缩仍然存在并改变不明显。6. OAB大鼠逼尿肌离体肌条实验结果,在离体肌条刺激收缩实验中,Cocktail能有效消除电刺激使膀胱产生的收缩,说明Cocktail能消除逼尿肌局部神经因素的影响。在OAB膀胱离体肌条自发兴奋收缩实验中,在加入Cocktail前后OAB肌条的自发兴奋收缩并没有被消除和降低,并且幅度有显著上升。结论:1. OAB膀胱不稳定收缩可能存在两种机制,即B-Poab和S-Poab。前者有盆神经传入、传出信号参与,这可能是尿急症状产生的神经信号基础,并且此种不稳定收缩能引发其它相关的神经肌电生理反射。而S-Poab没有中枢信号参与其收缩,也没有产生膀胱感觉并传入中枢和引发其它相关神经肌电生理反射。2.脊髓及膀胱周围神经损伤后B-Poab消失,而S-Poab不会因此截断而减弱。这更加确立了OAB膀胱部分不稳定收缩有神经因素参与,这成为解释尿急及相关继发症状的基础,但同时也证明了OAB膀胱有独立于神经控制影响的不稳定收缩,并且这种不稳定收缩的产生并不依赖于中枢和周围神经。3.离体的OAB逼尿肌在进一步消除膀胱局部神经因素的情况下,证实其过度的自发兴奋收缩没有减弱,说明OAB肌条的自发收缩有来自逼尿肌本身的兴奋,这可能是在体状态时不稳定收缩起源和存在的逼尿肌自身因素基础。第二部分过度活跃膀胱中雷诺定受体的初步研究背景和目的:过度活跃膀胱不稳定收缩中存在诸多因素变化,上述部分研究提示OAB膀胱不稳定收缩有来自逼尿肌本身的自发兴奋和收缩活性异常的肌源性基础。正常逼尿肌肌浆网上的雷诺定受体（ryanodine receptor;RyR）是细胞兴奋和收缩中一个重要的Ca2+信号调节通道,它的调节作用包括在局部短暂释放的钙形成钙闪烁(Ca2+sparks),并激活细胞膜上钙依赖钾通道(Ca2+-activated K+ channel;Kca)和负反馈调节电压依赖型Ca2+通道(voltage-dependent Ca2+ channel;VDCC),相应的调节逼尿肌膜兴奋性及自发性收缩,而这可能和OAB膀胱逼尿肌本身的自发兴奋收缩活性的升高可能相关。在本部分的研究中拟考察OAB膀胱逼尿肌内RyR通道的mRNA、蛋白表达是否存在改变,和RyR通道在OAB逼尿肌中对膜兴奋性及自发收缩调控功能等影响是否有显著变化,拟初步探讨它的改变与OAB中自发兴奋收缩过度可能联系。材料和方法:1.通过RT-PCR实验测定OAB大鼠模型逼尿肌组织的RyR通道亚型表达,通过β-action内参照半定量RT-PCR实验,分析确认RyR通道mRNA表达在OAB膀胱逼尿肌与正常膀胱逼尿肌之间是否存在差异。通过RyR通道蛋白western blot分析确认RyR通道蛋白表达在OAB膀胱逼尿肌与正常膀胱逼尿肌之间是否存在差异。2.正常离体膀胱肌条在Cocktail-PSS生理液中消除了局部神经因素影响后,分别应用VDCC钙通道阻滞剂（nimodipine）、RyR通道激动剂（caffeine）、和RyR通道阻滞剂（ryanodine）的情况下,观察和比较干预前后其自发兴奋收缩幅度和频率改变情况。同样对于OAB膀胱离体肌条进行观察,分析前后自发兴奋收缩频率和幅度变化,并且和正常进行比较,分析受药物干预后对自发兴奋收缩调控的差异。结果:1. RT-PCR提示OAB膀胱逼尿肌中RyR只表达RyR2亚型,和正常对照无亚型差异。半定量RT-PCR实验和western blot分析实验显示RyR通道mRNA和蛋白表达在OAB膀胱平滑肌中与正常逼尿肌相比都有显著降低。2.在Cocktail-PSS生理液孵浴中,对已有稳定自发性收缩的离体逼尿肌条纪录中,当加入RyR通道阻滞剂ryanodine后,正常组离体肌条自发收缩的频率显著升高,且升高后的频率特征和OAB膀胱离体肌条组频率比较无显著差异;而OAB组在ryanodine给予后自发收缩改变不显著。在caffeine应用后显示能显著抑制自发收缩活性,无论是OAB膀胱离体肌条还是正常离体肌条纪录中都是如此。在L-型Ca2+通道阻滞剂nimodipine给予后,能消除正常膀胱离体肌条自发收缩,对OAB膀胱离体肌条的自发收缩也几乎被消除,但仍还残留有微小收缩节律。结论:RyR通道在正常逼尿肌的自发收缩中起到负性调节作用,提示可能原因在于RyR通道的“钙闪烁”激活膜上Kca通道及和抑制VDCC通道的钙内流,从而降低膜兴奋性和收缩活性,同时发现OAB膀胱逼尿肌中RyR通道在离体的自发收缩活性调节中功能减弱和它的表达显著降低。提示RyR通道在正常逼尿肌自发收缩中负性作用机制在OAB膀胱逼尿肌中表现明显减弱,这可能是导致OAB膀胱逼尿肌自发收缩的过度活跃状态的可能因素之一。
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