Cdc42在甲型流感病毒NA蛋白修饰及转运中的作用

论文摘要

流感病毒神经氨酸酶（NA）具有酶活性,对病毒入侵和释放起重要作用。依据其特性,NA成为研究设计抗流感病毒药物最适合的靶点。目前,虽然有研究不断地对NA抑制剂进行改进,但是流感病毒株对这些药物依然迅速产生耐药性。因此,开发新的抗流感药物和找到新的作用靶点迫在眉睫。在宿主细胞中,很多宿主蛋白对流感病毒的复制过程都有重要影响。其中小分子G蛋白RhoGTPases三个重要的家族成员Cdc42、RhoA和Rac1作为分子开关,涉及多种细胞信号转导途径,参与多种细胞生物活动。而且越来越多的研究表明,它们参与胞内运输的调控。但是它们是否对NA蛋白胞内转运起作用,它们中究竟是哪个蛋白起作用还没有相关报道。本文对这一问题进行了研究。我们首先通过观察NA和NA（H274Y）突变体表达蛋白在细胞中定位的改变和检测NA（H274Y）突变体表面酶活的降低,建立起NA蛋白胞内转运研究体系。然后,用药物Toxin B处理转染NA的细胞,证实了Rho GTPases家族成员（Cdc42、 RhoA和Rac1）对NA蛋白胞内转运起促进作用。随后我们分别对Cdc42、RhoA和Rac1及它们相关持续活化和阻抑的突变体与NA蛋白的共定位进行观察,以及药物C3Transferase处理实验,证实是Cdc42起到促进作用。我们外源转入Cdc42一个特定的GTP酶活化蛋白（GAP）-ARHGAP21,抑制宿主细胞中Cdc42的活性,进一步证实内源Cdc42所起到的促进作用。我们又对Cdc42与NA蛋白的作用方式进行了探究。GST-pulldown试验表明可能Cdc42与NA之间并不存在直接的相互作用。用TGN和GM130分别标记高尔基体,Confocal试验表明Cdc42影响了NA蛋白从高尔基体向胞质及胞膜的转运过程。随后的Cytochalasin D处理试验,揭示Cdc42通过对肌动蛋白的调控而影响NA蛋白的转运。此外,我们还针对NA信号肽区域,构建了一系列的NA缺失突变体。我们发现,当NA跨膜区缺失10个以上氨基酸时,会导致NA蛋白不表达。我们对NA缺失11氨基酸的突变体进行了蛋白转运的研究,结果表明在细胞内的定位并未发生变化。上述研究结果表明,Cdc42在甲型流感病毒NA蛋白修饰及转运中起到明显的促进作用。其中Cdc42在NA蛋白转运中的作用机制仍需进一步深入研究。

论文目录

• 目录
• 英文缩写词说明
• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 一 甲型流感病毒研究综述
• 1 甲型流感病毒研究进展
• 1.1 流感概述
• 1.2 流感病毒概述
• 1.3 流感病毒的结构
• 1.4 流感病毒的基因组及编码的蛋白
• 1.5 流感病毒的生命周期
• 2 神经氨酸酶（Neuraminidase,NA）研究进展
• 2.1 神经氨酸酶NA的概述
• 2.2 神经氨酸酶NA的结构
• 2.3 神经氨酸酶NA的功能
• 二 小分子G蛋白Cdc42研究综述
• 1 小G蛋白Rho GTPases研究概述
• 1.1 Rho GTPases的概述
• 1.2 Rho GTPases生物活性及功能
• 2 小分子G蛋白Cdc42研究进展
• 2.1 小G蛋白Cdc42的概述
• 2.2 小G蛋白Cdc42的生物学功能
• 2.3 Cdc42在胞内运输中的作用
• 三 研究的目的和意义
• 参考文献
• 第二章 试验研究
• 一 材料与方法
• 1 质粒、菌种及细胞株
• 1.1 质粒
• 1.2 菌种
• 1.3 细胞株
• 2 仪器与设备
• 3 试验主要试剂
• 4 实验方法
• 2法）'>4.1 感受态菌体制备（CaCl₂法）
• 4.2 质粒构建
• 4.3 定点突变
• 4.4 细胞培养及转染
• 4.5 蛋白免疫印迹（Western blot）
• 4.6 免疫荧光实验（Confocal）
• 4.7 神经氨酸酶活力测定
• 4.8 GST-pull down实验
• 二 结果与分析
• 1 NA蛋白胞内转运研究体系的建立
• 1.1 真核表达质粒NA-WT和NA（H274Y）的构建
• 1.2 NA-WT和NA（H274Y）表达蛋白在胞内定位的变化
• 1.3 NA-WT和NA（H274Y）细胞表面活力的改变
• 2 筛选NA蛋白修饰与转运中起重要的作用的宿主蛋白
• 2.1 ToxinB处理NA蛋白在细胞内定位的变化
• 2.2 ToxinB处理NA蛋白细胞表面酶活力的改变
• 3 Rho GTPases家族成员对NA蛋白胞内转运的影响
• 3.1 真核表达质粒EGFP-（Cdc42、RhoA、Rac1）的构建
• 3.2 Cdc42、RhoA和Rac1对NA蛋白在细胞内定位的影响
• 3.3 药物C3 Transferase处理对NA蛋白胞内转运的影响
• 3.4 外源转入Cdc42对NA蛋白转运的影响
• 3.5 宿主细胞内源Cdc42对NA蛋白转运的影响
• 4 Cdc42与NA蛋白作用方式的探究
• 4.1 GST-pulldown实验验证Cdc42与NA蛋白之间的作用
• 4.2 NA蛋白通过Golgi途径向膜转运
• 4.3 Cytochalasin D对NA蛋白转运的影响
• 5 NA非极性跨膜区氨基酸的缺失对转运的影响
• 5.1 真核表达质粒NA缺失突变体的构建
• 5.2 真核表达质粒NA缺失突变体的蛋白表达
• Δ11AA蛋白转运的影响'>5.3 Cdc42对NA_Δ11AA蛋白转运的影响
• 三 试验结果总结与讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢