论文摘要
目的:通过观察PT孔在NAFLD大鼠及体外肝细胞脂肪变模型的状态变化,研究PT孔开放与NAFLD肝细胞凋亡的关系及可能的发生机制。方法:（1） 24只S-D雄性大鼠随机分为基础饲料组（正常对照组,C组）、高脂饲料组（脂肪肝组,F组）,其中C组取8周时相点,F组取4周、8周、12周3个时相点,每时相点6只动物。（2）动态观察各组:①血浆甘油三酯、游离脂肪酸、丙氨酸转氨酶、天门冬氨酸转氨酶变化;②HE染色光镜观察肝脏组织病理改变;③电镜观察肝细胞线粒体超微结构变化;④分光光度计检测肝细胞线粒体PT孔状态变化;⑤流式细胞仪AnnexinV/PI双标法检测肝细胞凋亡百分数;⑥免疫组织化学法及Western-blot检测Bcl-2、Bax、Cyt C在肝脏中的表达。（2）通过油酸诱导L02肝细胞脂肪变建立体外NAFLD脂肪变模型（S组）,按脂变时间分为0、24、48、72小时4个时相点,油酸诱导L02肝细胞脂肪变体外NAFLD模型加入PT孔特异拮抗剂CsA组（S+CsA组）,设正常L02肝细胞为对照组（L组）,动态观察各组:①荧光显微镜法观察PT孔的状态变化;②流式细胞仪AnnexinV/PI双标法检测肝细胞凋亡百分数;③免疫细胞化学法检测Cyt C、Bcl-2、Bax在肝细胞中的表达。结果:（1）①在F组血浆甘油三酯、游离脂肪酸、丙氨酸转氨酶、天门冬氨酸转氨酶随高脂饲料饲养时间延长呈上升趋势,在12周时达到高峰,差异具有显著性（P<0.05）;②HE染色结果显示:C组大鼠肝脏无异常发现;F组肝脏在4周时出现脂肪变,病理分级为2度脂肪变, 8周呈3度脂肪变,12周出现炎细胞浸润,进展为非酒精性脂肪性肝炎;③电镜下观察F组12周肝细胞线粒体,外室及嵴内间隙肿胀,部分内室肿胀;④PT孔开放情况:在Ca++诱导下, F组4周、8周线粒体PT孔开放比率较C组即有明显增加,以F组12周最为显著（P<0.05）。CsA作用下F组、C组无显著区别（P>0.05）;⑤F组与C组相比,细胞凋亡率呈增加趋势, F组4周与C组相比较有所增加但无显著差别（P>0.05）,高脂8周、高脂12周与对照组相比有显著差别（P<0.05）;⑥免疫组织化学染色显示: Bcl-2在C组的表达为散在弱阳性,F组4、8、12周阳性细胞数渐增加,并在脂肪变明显的部位着色深;Bax在C组呈弱阳性表达,在F组随脂肪变时间延长,表达逐渐增多,阳性细胞数增多,染色加深。Cyt C在C组肝细胞胞浆中呈黄色细颗粒,均匀分布,在F组随着时间延长,染色加深,表达量增多,弥漫分布;Western blot检测结果显示:F组Bcl-2、Bax、CytC蛋白的表达随着脂肪变时间延长增多, Bcl-2、Bax蛋白表达尤以F组12周明显,与C组比较,差异具有显著性（P<0.05）; Cyt C在F组4周、8周、12周较C组明显增加（P<0.05）,但F组间比较无显著差异（P>0.05）。（2）油酸与L02肝细胞共同孵育24小时后出现肝细胞脂肪变,提示NAFLD体外模型造模成功;①油酸可诱导S组0小时肝细胞PT孔开放,PT孔开放后24小时可引起肝细胞脂肪变,PT孔的特异阻断剂CsA可阻断PT孔的开放。Ca++作用下出现PT孔开放,但S组、L组比较无显著差异（P>0.05）。②AnnexinV/PI双标法流式细胞仪检测细胞凋亡率提示L组与S组24小时相比较无显著差异（P>0.05）,S组48小时、72小时细胞凋亡率明显增加,与L组比较有显著差异（P<0.05）。③免疫细胞化学显示Bcl-2、CytC在L组和S组0小时为弱阳性表达,散在棕黄色颗粒存在于细胞浆,以胞核周边为多见;Bax为弱阳性浅淡表达。随脂肪变时间延长,Bcl-2、Bax、CytC在S组表达逐渐增高,在72小时达到高峰,Bcl-2/Bax呈逐渐升高趋势。其中CytC、Bcl-2胞浆内呈深棕色弥漫存在,为强阳性表达;与L组比较有显著差异（P<0.05）。结论:1、PT孔开放介导的细胞凋亡途径参与了NAFLD肝细胞凋亡。2、Bcl-2蛋白家族参与PT孔介导的NAFLD肝细胞凋亡的调节,升高的Bcl-2/Bax在NAFLD发展过程中不能有效阻止肝细胞凋亡的发生。3、血浆和细胞内的FFA增多可引起肝细胞脂肪变,同时可引起NAFLD肝细胞PT孔开放,介导肝细胞凋亡。
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