Doxycycline对人肝癌细胞系HepG2增殖及凋亡的体外实验研究

论文摘要

目的:肝癌的发生与发展与肿瘤细胞的凋亡关系密切,因此诱导肝癌细胞凋亡的策略成为近年来肝癌治疗的重点。Doxycycline（多西环素）为四环素类抗生素的一种,被广泛用于多种微生物感染,已有研究表明它可对多种肿瘤有明显的生长抑制作用,如结肠癌、乳腺癌、胰腺癌及前列腺癌等,但其对肝癌的作用国内外却未见报道。本研究通过将不同浓度Doxycycline作用于人肝细胞性肝癌细胞系HepG2,观察Doxycycline对HepG2生长增殖和凋亡的作用,同时分别从蛋白及mRNA水平检测Fas、FasL及MMP-2表达情况,进而初步探讨其可能的作用机制。方法:1.不同浓度的Doxycycline（5、10、20、30和50mg/L）对体外培养人肝癌细胞系HepG2进行不同的时间干预（24、48和72h）,倒置显微镜观察肝癌细胞的生长状态并照相。2.MTT法检测经Doxycycline处理过的HepG2细胞的吸光度值（OD值）,计算细胞生长抑制率,并绘制随药物浓度变化的细胞生长抑制曲线。3.TUNEL法检测不同浓度Doxycycline（5和20mg/L）作用不同时间（24、48和72h）后细胞凋亡率的变化。4.流式细胞技术（FCM）测定不同浓度Doxycycline（5、10和20mg/L）作用不同时间（24、48和72h）对HepG2细胞生长周期的影响。5.20 mg/L Doxycycline作用HepG2细胞48h后制成细胞爬片,免疫细胞化学技术测定Fas、FasL及MMP-2蛋白在HepG2细胞的表达变化。6.不同浓度Doxycycline（5和20mg/L）作用HepG2细胞48h后,RT-PCR方法检测Fas、FasL及MMP-2 mRNA在HepG2细胞的表达变化。结果:1.不同浓度Doxycycline作用HepG2细胞48h和72h后,实验组大部分HepG2细胞变圆变小,胞体皱缩变形,出现较多的凋亡细胞,而作用24h后实验组细胞生长状态无明显变化。2.MTT法检测发现经不同浓度Doxycycline作用48及72h HepG2细胞生长被明显抑制,与对照组比较差异有统计学意义（p＜0.001）,且呈时间、浓度依赖趋势,而作用24h后实验组较对照组变化差异并不显著（p＞0.05）。3.20mg/L Doxycycline作用HepG2细胞48h和72h后,细胞凋亡率较对照组也明显升高（p＜0.01）,同样作用24h实验组细胞凋亡率与对照组比较无显著差异（p＞0.05）。4.流式细胞仪行细胞周期分析发现实验组HepG2细胞发生G1-S期阻滞,S期抑制。5.以20mg/L Doxycycline作用于HepG2细胞48h后,实验组FasL蛋白表达较对照组明显升高,MMP-2蛋白表达较对照组明显降低,两组差异均有统计学意义（p＜0.01）,而实验组Fas蛋白表达较对照组则差异无统计学意义（p＞0.05）。6.5、20mg/L Doxycycline作用HepG2细胞48h,同样可见实验组FasL mRNA表达较对照组升高,MMP-2 mRNA表达较对照组降低,而实验组Fas mRNA表达较对照组不明显。结论:1.Doxycycline可显著抑制人肝癌细胞系HepG2细胞的增殖,并促进其凋亡。2.Doxycycline对人肝癌细胞系HepG2细胞生长周期产生明显的G1-S阻滞,S期抑制。3.Doxycycline可能通过上调FasL蛋白表达、下调MMP-2蛋白从而启动Fas/FasL膜受体途径诱导HepG2细胞凋亡。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附图
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表论文
• 学位论文评阅及答辩情况表