基于蛋白质互作克隆新的水稻分蘖基因

论文摘要

水稻是世界上最重要的谷类作物之一,它为世界上的大部分人提供了主要的食物。研究发现水稻D3基因编码F-box-LRR蛋白,它参与新发现的植物激素独脚金内酯的信号转导过程,抑制分蘖芽伸长。本文的研究目的是用酵母双杂交的方法,筛选与D3蛋白相互作用的蛋白并验证蛋白互作,进一步了解独脚金内酯信号转导途径和独脚金内酯对分枝的调控机制。酵母双杂交系统利用了真核生物的GAL4转录因r和三个报告基因,可以灵敏地检测到弱的蛋白互作。因此构建了QD3、FBLRR14、LRR2-14三个诱饵（Bait）,并转化至酵母菌株Y187中。Y187-QD3、Y187-FBLRR14、Y187-LRR2-14在SD/-Trp/-His/X-a-Gal和SD/-Trp/-Ade/X-a-Gal两种营养缺陷型平板上不生长,说明这三个诱饵无自身转录激活活性。pGBKT7表达载体上带有c-Myc标签,用特异性的c-Myc抗体进行Westen blot检测,证明QD3、FBLRR14、LRR2-14融合蛋白可以在酵母菌内正常表达。由于D3参与独脚金内酯的信号转导,推测D3蛋白与目的蛋白互作时需要独脚金内酯的存在或者独脚金内酯可增强D3蛋白与目的蛋白的互作。GR24是人工合成的独脚金内酯类似物,与独脚金内酯有同样的功能。用QD3、FBLRR14、LRR2-14三个诱饵分别筛选水稻分蘖芽cDNA文库,此外还在加有1μM GR24的情况下再次筛选水稻分蘖芽cDNA文库,观察新激素对蛋白互作的影响。QD3 Bait在不加GR24时筛选得到六个重要的阳性克隆,QD3 Bait在加了GR24时筛选得到三个重要的阳性克隆,LRR2-14Bait在加了GR24时筛选得到九个重要的阳性克隆,FBLRR14未筛选出重要的阳性克隆。将筛选出的重要克隆重新转入酵母菌株AH109中,分别与FBBait, LRRBait、QD3 Bait、LRR2-14Bait进行小规模的杂交,得到的合子在QDO/X-a-Gal+GR24平板上验证。验证得到A62、A113、A128、B13、B27、GL91、GL96、GL110、GL122、GL136、GU40、GL158共12个重要克隆与诱饵蛋白互作。推测它们很可能与D3蛋白相互作用,参与独脚金内酯信号转导途径,调控水稻分蘖。将构建好的MBP-D3融合蛋白表达载体在大肠杆菌中原核表达并纯化MBP-D3融合蛋白,为下一步做MBP-Pull down验证蛋白互作提供了必要的前提条件。为了用免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）的方法在植物体内验证蛋白互作,构建了2个植物表达载体。这些载体中插入的D3基因在N端或C端带有FLAG标签,便于用商业化的anti-FLAG抗体进行Co-IP,并且还构建了4个含TAPa标签的融合蛋白表达载体并已转化水稻日本晴,这些载体中含有6×His和9×myc,便于以后通过串联亲和纯化分离D3蛋白复合体,结合质谱分析确定相互作用蛋白。本实验筛选得到的重要克隆及后期的验证工作为进一步阐明独脚金内酯信号转导途径和水稻分蘖机理奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 分蘖的控制
• 1.2 穗分枝的控制
• 1.3 分蘖和穗分枝的协同调节
• 1.4 结论
• 2 研究内容
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 水稻品种、菌株、载体及引物
• 2.1.2 工具酶
• 2.1.3 其他试剂及试剂盒
• 2.1.4 试剂配制
• 2.1.4.1 培养基
• 2.1.4.2 抗生素贮存液
• 2.1.4.3 化学贮存液
• 2.1.4.4 质粒提取试剂
• 2.1.4.5 植物基因组DNA提取试剂
• 2.1.4.6 电泳缓冲液及试剂
• 2.1.4.7 Western Blot缓冲液
• 2.1.4.8 GUS染色试剂
• 2.1.4.9 MBP融合蛋白纯化
• 2.1.5 仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 构建植物表达载体的步骤
• 2.2.1.1 植物总RNA的提取
• 2.2.1.2 植物基因组DNA的提取
• 2.2.1.3 目的基因的扩增
• 2.2.1.4 目的基因的回收
• 2.2.1.5 目的基因之间的连接
• 2.2.1.6 连接产物与克隆载体的连接
• 2.2.1.7 目的片段和表达载体的连接
• 2.2.1.8 转化大肠杆菌感受态细胞并提质粒
• 2.2.1.9 酶切鉴定重组质粒
• 2.2.1.10 测序
• 2.2.1.11 农杆菌感受态细胞的制备和转化
• 2.2.1.12 农杆菌质粒的提取
• 2.2.2 Co-IP植物表达载体的构建
• 2.2.3 TAPa植物表达载体的构建
• 2.2.4 水稻的遗传转化
• 2.2.5 转基因水稻的鉴定
• 2.2.6 GUS染色
• 2.2.7 酵母双杂交
• 2.2.7.1 构建诱饵融合蛋白表达载体
• 2.2.7.2 酵母感受态细胞的制备
• 2.2.7.3 转化酵母感受态细胞
• 2.2.7.4 提取酵母质粒
• 2.2.7.5 诱饵酵母菌株的检测
• 2.2.7.6 诱饵菌株筛选水稻分蘖芽cDNA文库
• 2.2.7.7 获得重要的阳性克隆
• 2.2.8 验证酵母双杂交筛选出的重要阳性克隆
• 2.2.8.1 重要阳性克隆质粒转入AH109感受态细胞
• 2.2.8.2 小规模酵母双杂交
• 2.2.8.3 QDO/X-α-Gal+GR24验证
• 2.2.9 MBP-D3融合蛋白的原核表达及纯化
• 2.2.9.1 MBP-D3融合蛋白表达载体的构建
• 2.2.9.2 MBP-D3融合蛋白的原核表达
• 2.2.9.3 MBP-D3融合蛋白的透析及定量
• 2.2.9.4 MBP-D3融合蛋白与beads结合
• 2.3 结果及分析
• 2.3.1 植物总RNA和DNA的提取
• 2.3.2 Co-IP植物表达载体的构建
• 2.3.2.1 目的基因的扩增和测序
• 2.3.2.2 目的片段和表达载体的酶切回收
• 2.3.2.3 目的片段连入表达载体的酶切鉴定
• 2.3.2.4 载体转化农杆菌
• 2.3.3 TAPa植物表达载体的构建
• 2.3.3.1 目的基因的扩增和测序
• 2.3.3.2 目的片段和表达载体的酶切回收
• 2.3.3.3 目的片段连入表达载体的酶切鉴定
• 2.3.3.4 载体转化农杆菌
• 2.3.4 水稻的遗传转化
• 2.3.5 转基因水稻的鉴定
• 2.3.6 GUS染色
• 2.3.7 酵母双杂交
• 2.3.7.1 构建诱饵融合蛋白表达载体
• 2.3.7.2 诱饵菌株的检测
• 2.3.7.3 诱饵菌株筛选水稻分蘖芽cDNA文库
• 2.3.8 酵母回交验证重要阳性克隆
• 2.3.9 MBP-D3融合蛋白的原核表达及纯化
• 2.3.9.1 MBP-D3融合蛋白表达载体的构建
• 2.3.9.2 MBP-D3融合蛋白的原核表达及纯化
• 2.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 后记
• 攻读学位期间取得的科研成果清单