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MC-LR暴露影响MMPs表达和肿瘤瘤转移的分子机理研究

2020-12-11阅读(705)

MC-LR暴露影响MMPs表达和肿瘤瘤转移的分子机理研究

论文摘要

随着湖泊富营养化状况的加剧,蓝藻水华污染日趋严重。藻华期间铜绿微囊藻等优势藻种会向水体释放出过量的微囊藻毒素,微囊藻毒素（MC-LR）因其对鱼类、鸟类以及哺乳动物的肝脏组织造成特异性损伤而受到较多毒理研究关注。流行病学和实验研究已证实,MC-LR暴露可以诱导肿瘤发生。基质金属蛋白酶（MMPs）表达介导细胞浸润和转移是诱发肿瘤术后转移的重要机制。本研究旨在探讨微囊藻毒素与肿瘤转移之间联系及其相关效应机理,以进一步评估太湖蓝藻水华具有的潜在促癌风险。研究方法与结果如下：太湖水原位慢性暴露对小鼠肝脏损伤与MMP-2/-9表达影响：根据太湖富营养化程度选取梅梁湾（M1和M2）、湖心（H）以及胥口湾（X）4个样点采集水样。对包括对照组在内的5组小鼠进行90d自由饮水暴露后,M1、M2组小鼠肝脏组织出现了炎症病灶、细胞肿胀等明显的病理损伤；免疫组化结果表明M1组小鼠的MMP-2酶活性提高,而M2组的MMP-9酶活受到明显抑制；酶联免疫结合实验显示M2组小鼠肝脏中MMP-2蛋白含量由对照组的2.9ng/g肝重提高到3.5ng/g肝重p<0.05)。实时定量PCR发现,M1组小鼠的MMP-2mRNA转录水平比对照组上调了1.73倍,而M2组的MMP-9下调了2.2倍。结论：水华污染严重的太湖水暴露可导致明显的小鼠肝脏组织病理损伤,同时显著影响MMP-2/-9表达,由于MMP-2/-9表达与肿瘤转移过程关系密切,说明太湖水体可能对周边人群具有潜在健康风险。MC-LR慢性暴露对小鼠肝脏损伤与MMP-2/-9表达的影响：使用不同浓度的纯MC-LR （0、1、40和80gg/l）对小鼠进行180d/270d慢性染毒实验。组织切片观察发现除高浓度组（40和80μg/1）肝脏出现明显损伤外,低浓度组（1μg/1）染毒小鼠肝脏组织在270天后也出现轻微损伤；免疫组化与酶联免疫结合实验显示高浓度染毒组的小鼠肝脏MMP-2/-9蛋白表达显著提高,小鼠经270d暴露后,肝脏MMP-2蛋白含量从对照组的2.1ng/g肝重提高到了80μg/l组的3.5ng/gp<0.05)；实时定量PCR结果显示,180d暴露后40与80μg/l组mmp-2的转录量分别上调了4.9与6.9倍,mmp-9则上调了2.8与5.0倍,270d暴露后1μg/l组mmp-2转录量也显著提高了36%p<0.05)。结论：MC-LR的长期低剂量暴露可诱导潜在肝脏毒性,并可促进MMP-2/-9在各个生物学水平上的表达。MC-LR体外染毒对肿瘤细胞浸润和转移及MMPs表达的影响：采用体外培养的MDA-MB-435s乳腺癌细胞株作为受试体系进行MC-LR染毒。MTT实验与流式细胞术检测结果显示低于50nM的MC-LR对细胞活力与周期无显著性影响；划痕愈合与Transwell实验证明,肿瘤细胞的迁移与侵袭能力表现为显著的时间与剂量正相关性p<0.05)；明胶酶谱与蛋白免疫印迹实验证实胞外与胞内MMP-2的蛋白表达量均显著提高；实时定量PCR结果表明细胞mmp-2的转录水平在25nM与100nM组分别上调了5.5倍和9.0倍（p<0.05）。结论：MC-LR暴露可促进MDA-MB-435s肿瘤细胞的浸润和转移,同时可诱导MMP-2/-9的过量表达,因此MC-LR暴露可增加肿瘤转移的健康风险。MC-LR促肿瘤转移分子机制初步研究：25nM MC-LR染毒72h后,应用肿瘤转移基因功能芯片（Tumor metastasis PCR Array, Catalog No. PAHS-028A）分析MDA-MB-435s乳腺癌细胞株84个肿瘤转移相关基因的转录表达情况。统计发现52个基因出现了上调,其中12个超过1.5倍,其余32个基因下调,其中4个基因下调超过了1.5倍。表达上调超过2.0倍的基因共8个,分别为Cdhl1、 Igf1、Il8rb、mmp13、mmp2、mmp9、Pnn和Rbl；基因功能分析结果表明,在这些基因所编码的蛋白或细胞因子对肿瘤转移的过程产生不同程度的正向调节作用。结论：MC-LR暴露对肿瘤细胞转移过程产生了较大的诱导影响,可能是通过对多个基因表达的协调作用促进肿瘤细胞浸润转移。综上所述,本项研究表明,微囊藻毒素暴露可引起生物体内MMPs等功能酶的差异表达,并诱导肿瘤细胞迁移与侵袭,从而增加恶性肿瘤转移、复发的潜在健康风险。

论文目录

  • 目录
  • 摘要
  • Abstract
  • 第1章 绪论
  • 1.1 研究背景
  • 1.1.1 太湖蓝藻水华污染现状
  • 1.1.2 微囊藻毒素毒理研究综述
  • 1.1.3 水华地区肝癌流行病学调查
  • 1.1.4 肿瘤转移机制与基质金属蛋白酶研究
  • 1.2 选题依据与研究目的
  • 1.3 研究内容和技术思路
  • 参考文献
  • 第2章 太湖水慢性暴露对小鼠肝脏损伤与MMP-2/-9表达的影响
  • 2.1 引言
  • 2.2 材料与方法
  • 2.2.1 太湖采样点设置与水样采集
  • 2.2.2 实验动物暴露处理
  • 2.2.3 肝脏组织切片实验
  • 2.2.4 免疫组织化学实验
  • 2.2.5 酶联免疫实验ELISA
  • 2.2.6 RNA提取与cDNA合成
  • 2.2.7 实时定量PCR
  • 2.3 结果与讨论
  • 2.3.1 太湖水暴露小鼠肝脏组织病理学变化
  • 2.3.2 太湖水暴露小鼠肝脏中MMPs酶活水平变化
  • 2.3.3 太湖水暴露小鼠肝脏MMPs蛋白浓度变化
  • 2.3.4 太湖水暴露小鼠的肝脏MMPs mRNA转录水平变化
  • 2.4 本章小结
  • 参考文献
  • 第3章 MC-LR慢性暴露对小鼠肝脏损伤与MMP-2/-9表达的影响
  • 3.1 引言
  • 3.2 材料与方法
  • 3.2.1 MC-LR浓度设定与溶液配置
  • 3.2.2 实验动物暴露处理
  • 3.2.3 肝脏组织切片实验
  • 3.2.4 免疫组织化学实验
  • 3.2.5 酶联免疫实验ELISA
  • 3.2.6 RNA提取与cDNA合成
  • 3.2.7 实时定量PCR
  • 3.3 结果与讨论
  • 3.3.1 MC-LR染毒后小鼠肝脏组织病理学变化
  • 3.3.2 MC-LR染毒后小鼠肝脏MMPs酶活水平变化
  • 3.3.3 MC-LR染毒后小鼠肝脏MMPs蛋白浓度变化
  • 3.3.4 MC-LR染毒后小鼠肝脏MMPs mRNA转录水平变化
  • 3.4 本章小结
  • 参考文献
  • 第4章 MC-LR体外染毒对肿瘤细胞浸润和转移及MMPs表达的影响
  • 4.1 引言
  • 4.2 材料与方法
  • 4.2.1 肿瘤细胞株MDA-MB-435s培养与MC-LR染毒
  • 4.2.2 MTT实验
  • 4.2.3 流式细胞术检测
  • 4.2.4 细胞划痕愈合实验
  • 4.2.5 Transwell小室穿孔实验（细胞侵袭试验）
  • 4.2.6 明胶酶谱实验
  • 4.2.7 Western blot蛋白免疫结合
  • 4.2.8 实时定量PCR
  • 4.3 结果与讨论
  • 4.3.1 MC-LR暴露对MDA-MB-435s细胞活力的影响
  • 4.3.2 MC-LR暴露对MDA-MB-435s细胞周期的影响
  • 4.3.3 MC-LR暴露对MDA-MB-435s细胞迁移与侵袭能力的影响
  • 4.3.4 MC-LR暴露对MDA-MB-435s细胞MMPs表达的影响
  • 4.3.5 MC-LR暴露对MDA-MB-435s MMPs mRNA的转录水平影响
  • 4.4 本章小结
  • 参考文献
  • 第5章 MC-LR促肿瘤转移分子机制初步研究
  • 5.1 引言
  • 5.2 材料与方法
  • 5.2.1 肿瘤细胞株MDA-MB-435s培养与MC-LR染毒
  • 5.2.2 mRNA抽提纯化
  • 5.2.3 cDNA合成
  • 5.2.4 功能基因组芯片检测
  • 5.2.5 数据处理与芯片结果分析
  • 5.3 结果与讨论
  • 5.3.1 肿瘤细胞侵袭转移相关基因表达检测
  • 5.3.2 MC-LR暴露诱导基因差异表达及其功能分析
  • 5.4 本章小结
  • 参考文献
  • 第6章 结论与展望
  • 6.1 结论
  • 6.2 研究展望
  • 第7章 创新点
  • 项目支持
  • 成果清单
  • 致谢

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