胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ △orf1缺失株的构建及生物学特性研究

论文摘要

猪传染性胸膜肺炎（Porcine Contagious Pleuropneumonia,PCP）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）引起的猪的一种高度接触传染性呼吸道疾病,给世界各地的养猪业造成了巨大的经济损失。目前该病的主要预防控制措施是疫苗免疫接种。商品化的全菌灭活疫苗和亚单位疫苗虽然能够减轻对同源血清型菌感染引起的临床症状并降低死亡率,但不能降低发病率和阻止肺部病变,对异源血清型菌的感染也不能提供完全的交叉保护,因此,迫切需要安全、高效的新型疫苗来预防和控制该病的发生与流行。与灭活疫苗和亚单位疫苗相比,弱毒活疫苗能够重复提呈抗原和持续性刺激免疫应答,其免疫效果优于灭活苗和亚单位疫苗。通过缺失APP的毒力因子构建弱毒活疫苗现已成为国内外疫苗研究的热点和未来发展的方向。鉴于上述背景,本研究旨在以本实验室林荔雯博士构建的APP血清1型apxⅠC和apxⅡC双基因缺失菌株SLW03（APP-1,△apxⅠC/△apxⅡC）为亲本菌,通过基因工程同源重组技术,缺失毒素ApxⅣ的激活因子orf1基因,构建不含抗性标记的APP基因缺失突变菌株SLW05,使其成为一个安全并能提供有效交叉保护的APP弱毒活疫苗菌株,为预防和控制猪传染性胸膜肺炎的发生与流行提供技术支持,本研究的主要内容包括:1.重组自杀性质粒（pEMORF）的构建参照GenBank（No:AF021919）中毒素ApxⅣ基因的序列,从APP血清1型野生菌株SLW01中扩增orf1基因的上下游同源臂片段,将得到的上下游同源臂片段连接到携带蔗糖敏感基因（SacB）的自杀性质粒pEMOC2上,构建重组自杀性质粒pEMORF,经酶切鉴定重组自杀性质粒构建正确。2.基因缺失菌株的筛选与鉴定以转化了重组自杀性质粒pEMORF的大肠杆菌p2155为供体,分别以SLW01菌株和SLW03菌株为受体菌进行接合转移使其发生第一次同源重组,筛选出Cm抗性（CmR）蔗糖敏感（SurS）的接合子,用PCR鉴定重组自杀性质粒已经整合到染色体中,即发生了第一次同源重组;将鉴定正确的接合子在TSB培养基中培养促使其发生第二次同源重组,筛选出Cm敏感（CmS）蔗糖抗性（SurR）的克隆,用PCR进行鉴定,以确定发生了第二次交换,从而得到基因缺失株,分别命名为SLW04和SLW05。3.基因缺失菌株的生物学特性研究将基因缺失菌株连续传代培养,通过PCR鉴定,证明基因缺失菌株能够稳定遗传。将基因缺失菌株和亲本菌株进行活菌计数,绘制生长曲线,结果表明,基因缺失菌株与亲本菌株比较,生长没有发生明显的变化,说明orf1基因的缺失对APP-1的生长无影响。进一步测定基因缺失菌株和亲本菌株对Balb/C小鼠的毒力,通过LD50发现基因缺失菌株与亲本菌株相比毒力有所降低。4.基因缺失菌株SLW05（△apxⅠC/△apxⅡC/△orf1）对仔猪的致病性试验分别将SLW03菌株和SLW05菌株通过气管注射途径对仔猪进行感染,感染剂量都为3×109CFU,感染后每天观察临床症状,测量体温,连续观察7d。结果显示,对仔猪的致病性SLW05菌株比SLW03菌株弱,说明ApxⅣ在APP致病过程中扮演着一定的作用。5.基因缺失菌株SLW05（△apxⅠC/△apxⅡC/△orf1）对仔猪的免疫效力试验分别将SLW03菌株和SLW05菌株通过气管注射途径免疫断奶仔猪,免疫2次,间隔2周;一免后2周和二免后2周分别检测毒素ApxⅠ、ApxⅡ和ApxⅣ的ELISA抗体水平;二免后2周,分别用SLW01（APP-1）菌株和CJ03（APP-3）菌株通过气管注射途径进行攻毒,观察临床症状,测量体温,7天后剖杀,计算肺损伤指数。结果显示,SLW05菌株免疫组比SLW03菌株免疫组的肺损伤小（P＜0.05）。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 第1章 文献综述
• 1.1 猪传染性胸膜肺炎研究进展
• 1.1.1 猪传染性胸膜肺炎的危害
• 1.1.2 猪传染性胸膜肺炎病原学
• 1.1.2.1 胸膜肺炎放线杆菌的发现历史
• 1.1.2.2 胸膜肺炎放线杆菌的生物学特性及血清分型
• 1.1.2.3 胸膜肺炎放线杆菌的毒力因子
• 1.1.3 胸膜肺炎放线杆菌的外毒素研究进展
• 1.1.4 猪传染性胸膜肺炎的防治
• 1.1.4.1 药物治疗
• 1.1.4.2 免疫预防
• 1.2 APP突变株构建方法的研究进展
• 1.2.1 自然突变
• 1.2.2 人工化学诱变
• 1.2.3 分子生物学方法
• 1.2.3.1 转座子突变技术
• 1.2.3.2 同源重组技术
• 第2章 研究的目的和意义
• 第3章 材料和方法
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 菌株、质粒和培养条件
• 3.1.2 酶、抗生素及试剂盒
• 3.1.3 培养基及抗生素的配制
• 3.1.4 主要溶液的配制
• 3.1.4.1 常用贮存液的配制
• 3.1.4.2 细菌基因组DNA提取溶液
• 3.1.5 引物
• 3.1.6 实验动物
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 胸膜肺炎放线杆菌的增殖
• 3.2.2 胸膜肺炎放线杆菌基因组的提取
• 3.2.3 PCR产物和酶切产物的回收与纯化
• 3.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 3.2.5 连接产物的转化
• 3.2.6 质粒的制备
• 3.2.7 重组质粒的鉴定
• 3.2.8 orfl基因上下游同源臂的克隆与鉴定
• 3.2.9 重组自杀性质粒pEMORF的构建
• 3.2.10 胸膜肺炎放线杆菌基因缺失株的构建
• 3.2.11 缺失菌株生物学特性的研究
• 3.2.11.1 缺失株生长特性的研究
• 3.2.11.2 缺失株遗传稳定性的研究
• 3.2.12 缺失菌株对小鼠的毒力试验及LD50的测定
• 3.2.13 缺失株与亲本株的致病性比较
• 3.2.14 缺失菌株对断奶仔猪的免疫保护试验
• 第4章 结果与分析
• 4.1 重组自杀性质粒pEMORF的构建
• 4.1.1 orf基因上下游片段的扩增与测序
• 4.1.2 重组自杀性质粒pEMORF的构建
• 4.2 基因缺失株的筛选和鉴定
• 4.2.1 基因缺失株SLW04的筛选和鉴定
• 4.2.2 基因缺失株SLW05的筛选和鉴定
• 4.3 突变株生物学特性的研究
• 4.3.1 突变株生长特性的研究
• 4.3.2 突变株遗传稳定性的研究
• 4.4 缺失菌株的毒力研究
• 4.4.1 缺失菌株对小鼠LD50的测定
• 4.4.2 缺失株与亲本株对仔猪致病性的比较
• 4.5 缺失株SLW05对断奶仔猪的免疫保护试验
• 4.5.1 免疫仔猪血清抗体检测结果
• 4.5.2 临床症状
• 4.5.3 攻毒后仔猪的体温变化
• 4.5.4 肺损伤
• 4.5.5 细菌的回收鉴定
• 第5章 讨论
• 5.1 对亲本菌株的选择
• 5.2 基因缺失株的毒力
• 5.3 缺失株的免疫保护性试验
• 5.4 展望
• 第6章 结论
• 参考文献
• 致谢