枯草芽孢杆菌G8抗菌物质的理化性质分析及分离纯化

论文摘要

本论文以黄瓜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum为指示菌测定枯草芽孢杆菌G8菌株代谢产物抗菌蛋白的抗菌活性、作用特性及盆栽和田间防病作用,并对抗菌蛋白进行分离纯化和特性分析,从而为进一步生防应用打下基础。平板对峙法测得G8菌株和平板打孔法测得其发酵代谢产物均具广谱抗菌活性。对黄瓜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum、棉花枯萎病菌Fusarium oxysporum fsp. vesinfectum、黄瓜蔓枯病菌Ascochyta citrullina Smith、棉花立枯病菌Rhizoctonia solani、烟草黑胫病菌Phytophthora parasitica var.nicotianae、棉花红腐病菌Fusarium moniliforme var. intermedium、棉花黑斑病菌Xanthomonas campestris pv. Malvacearum、番茄叶霉病菌Cladosporium flulvum、小麦纹枯病菌Rhizoctonia cerealis、棉花炭疽病菌Colletotrichum gossypii Southw、黄瓜腐霉病菌Pythium aphanidermatum、西洋参疫病菌Phytophthora cactorum、大蒜灰霉病菌Botrytis cinerea和番茄早疫病菌Alternaria solani Soraue均具有拮抗活性。温室防病试验结果表明拮抗菌G8发酵液200mL/L稀释液控制黄瓜菌核病的保护效果为66.67%,治疗效果为60.87%,均低于化学药剂。土壤处理试验表明在土壤中接种病原菌后36h后再接种拮抗菌,G8发酵液对黄瓜菌核病有很好的治疗作用,喷施拮抗菌液过早或过晚则影响防效。说明G8发酵液不适于直接进行生物防治,需对其抗菌物质进行研究。枯草芽孢杆菌G8无菌发酵液经40%硫酸铵饱和度沉淀得抗菌蛋白。抗菌蛋白抑菌谱广,对供试病原真菌棉花红腐病菌Fusarium moniliforme var. intermedium抑制率在60%80%之间;对黄瓜蔓枯病菌Ascochyta citrullina Smith、黄瓜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum、番茄叶霉病菌Cladosporium flulvum、番茄早疫病菌Alternaria solani Soraue、棉花炭疽病菌Colletotrichum gossypii Southw和西洋参疫病菌Phytophthora cactorum的抑菌率在80%以上。为确定其发酵液代谢产物抗菌蛋白产生的最佳培养基和培养条件,用40%硫酸铵沉淀法从无菌发酵液中提取抗菌蛋白并测定其对黄瓜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum的拮抗活性。结果表明G8产生抗菌蛋白的最佳培养基为LB培养基,最佳发酵pH值、温度、接种量、培养时间和摇床转速分别为pH7.0、37℃、30%、36h和180r/m。在此发酵条件下,菌体生长量与抑菌蛋白的产量均达到最大且菌体生长量与抗菌蛋白的产生量呈正相关。抗菌蛋白的特性分析如下:部分耐酸,将其pH值调为1.0作用16h后对黄瓜菌核病菌的抑制率为69.2%;耐高温,抗菌蛋白经100℃处理60min保持原有活性的80.8%,80℃对抗菌蛋白结构无破坏作用;部分耐有机溶剂和紫外线。抗菌蛋白可在常温条件下长期储存而不失活。显微观察结果表明抗菌蛋白可使黄瓜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum菌丝消融、原生质渗漏、菌丝细胞泡囊化、分叉增多。此外抗菌蛋白还能够抑制黄瓜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum菌核的萌发。G8产生的挥发性抗菌物质可以使黄瓜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum丝体粗细不等,泡囊化,菌丝体内原生质褐化,凝聚,但无外溢现象。抗菌粗蛋白经Sephadex G-100分子筛柱层析后得两个活性洗脱峰,取活性高的组分进行浓缩,SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度得两条电泳图带,分别将条带切下,缓冲液提取后平板打孔法检测,其中一条小分子带有抑菌活性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 黄瓜菌核病研究概况
• 1.1.1 黄瓜菌核病病原
• 1.1.2 黄瓜菌核病发病症状
• 1.1.3 黄瓜菌核病的发生规律
• 1.1.4 黄瓜菌核病防治措施
• 1.1.5 存在问题
• 1.2 枯草芽孢杆菌研究概况
• 1.2.1 国内外应用研究现状
• 1.2.2 枯草芽孢杆菌抗菌物质的研究
• 1.2.3 枯草芽孢杆菌抗菌物质的作用机理
• 1.3 生物防治存在问题与展望
• 1.3.1 生物防治存在的问题
• 1.3.2 生物防治前景展望
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 供试菌株
• 2.1.2 供试培养基
• 2.1.3 供试黄瓜品种
• 2.1.4 主要仪器与试剂
• 2.2 拮抗菌株抑菌活性测定方法
• 2.2.1 生长速率法
• 2.2.2 平板打孔法
• 2.2.3 平板对峙法
• 2.3 拮抗菌株的保藏与活化
• 2.4 拮抗菌株活性测定及其抑菌谱
• 2.5 G8 发酵液盆栽防效
• 2.5.1 黄瓜菌核病接种方法
• 2.5.2 叶片处理防效
• 2.5.3 土壤处理防效
• 2.6 无菌发酵液的制备方法
• 2.7 抗菌蛋白的提取及含量测定
• 2.7.1 抗菌蛋白的提取
• 2.7.2 蛋白含量测定方法
• 2.8 G8 培养条件优化
• 2.8.1 最佳培养基筛选
• 2.8.2 培养条件的优化
• 2.9 无菌发酵液抑菌活性及作用特性
• 2.9.1 无菌发酵液的抗菌谱
• 2.9.2 无菌发酵液对黄瓜菌核病菌丝的毒力测定
• 2.9.3 无菌发酵液对菌核萌发的抑制作用
• 2.10 抗菌粗蛋白的特性分析与活性测定
• 2.10.1 抗菌蛋白的制备
• 2.10.2 抗菌粗蛋白的特性
• 2.10.3 抗菌蛋白粗提液的抗菌谱
• 2.10.4 抗菌粗蛋白对黄瓜菌核病菌丝生长的毒力
• 2.10.5 抗菌粗蛋白对菌核萌发的抑制作用
• 2.10.6 抗菌粗蛋白抑菌机理
• 2.11 抗菌蛋白的分离纯化
• 2.11.1 Sephadex G-100 凝胶层析
• 2.11.2 纯度检测及分子量的测定
• 2.12 挥发性抗菌物质
• 2.12.1 挥发性物质活性测定方法
• 2.12.2 挥发性物质的抗菌谱
• 2.12.3 挥发性抗菌物质对菌核萌发的影响
• 2.12.4 挥发性抗菌物质对菌丝形态的影响
• 3 结果与分析
• 3.1 拮抗菌株的抑菌谱
• 3.2 发酵液室内盆栽防效
• 3.2.1 叶片处理防效
• 3.2.2 土壤处理防效
• 3.3 抗菌蛋白的提取及含量测定
• 3.3.1 抗菌蛋白的提取
• 3.3.2 蛋白的含量测定标准曲线
• 3.4 拮抗菌培养条件优化
• 3.4.1 培养基种类对G8 抗菌蛋白产生及活性的影响
• 3.4.2 pH 值对抗菌蛋白产生的影响
• 3.4.3 培养温度对抗菌蛋白产生的影响
• 3.4.4 培养时间对抗菌蛋白产生的影响
• 3.4.5 装液量对抗菌蛋白产生的影响
• 3.4.6 摇床转速对抗菌蛋白产生的影响
• 3.5 无菌发酵液抑菌活性测定
• 3.5.1 无菌发酵液的抑菌谱
• 3.5.2 无菌发酵液对黄瓜菌核病菌丝的毒力
• 3.5.3 无菌发酵液对黄瓜菌核病菌菌核萌发的抑制作用
• 3.6 抗菌蛋白的特性与活性测定
• 3.6.1 抗菌蛋白的特性
• 3.6.2 抗菌蛋白的抗菌谱
• 3.6.3 抗菌蛋白对黄瓜菌核病菌丝生长的毒力
• 3.6.4 抗菌蛋白对菌核萌发的抑制作用
• 3.6.5 抗菌蛋白作用特性
• 3.7 抗菌蛋白的分离纯化与性质分析
• 3.7.1 Sephadex G-100 凝胶层析
• 3.7.2 SDS-PAGE 电泳
• 3.8 挥发性抗菌物质
• 3.8.1 挥发性物质抗菌活性测定
• 3.8.2 挥发性物质的抗菌谱
• 3.8.3 挥发性物质对菌核萌发的影响
• 3.8.4 挥发性物质对菌丝形态的影响
• 4 讨论
• 4.1 黄瓜菌核病的生物防治研究
• 4.2 抗菌蛋白的性质
• 4.3 拮抗菌G8 的田间应用前景
• 5 结论
• 5.1 枯草芽孢杆菌G8 的发酵条件
• 5.2 抗菌蛋白的理化特性和性质
• 5.3 抗菌蛋白对黄瓜菌核病菌的作用特性
• 5.4 抗菌蛋白的纯化
• 6 参考文献
• 7 致谢
• 8 攻读学位期间发表论文