抗乙型肝炎病毒药物的筛选和研究

论文摘要

目的（1）利用HepG2.2.15细胞培养体系,以乙型肝炎表面抗原（hepatitis Bsurface antigen,HBsAg）和乙型肝炎e抗原（hepatitis B e antigen,HBeAg）为指标对样品库进行体外抗乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）活性筛选;（2）对筛选出有活性的样品研究其作用机制:检测样品对HBV DNA拷贝数,对HBVDNA聚合酶和HepG2.2.15细胞接种裸鼠HBsAg、HBeAg水平的影响;（3）构建一种检测HBX（hepatitis B x antigen,HBxAg）蛋白的质粒,研究抗HBV药物的作用机制和作用特点。方法选用阿德福韦为阳性药,用MTT法检测样品对HepG2.2.15细胞的毒性,ELISA法检测细胞上清中HBsAg、HBeAg的变化,以细胞的半数毒性浓度(median toxic concentration,TC50)、半数抗原分泌抑制浓度(median infectiveconcentration,IC50)、治疗指数（therapeutic index,TI）为指标,对162个样品进行初筛,筛选出有抗HBV活性样品,并进一步复筛确认。选择两个代表性的黄酮类化合物No.322、No.223进行初步构效关系研究。选用拉米夫定为阳性药用,实时荧光定量PCR法（Taqman探针法）观察其对HepG2.2.15细胞中HBV DNA拷贝数的影响。同位素法检测No.322对HBV DNA聚合酶的影响;用HepG2.2.15细胞接种裸鼠,观察样品对裸鼠血清HBsAg、HBeAg水平的影响。构建检测HBX蛋白的质粒:PCR扩增选择性激活序列——HBVEnhancerⅠ,插入到分泌型碱性磷酸酶（secreted alkaline phosphatase,SEAP）报告基因表达载体上游,构建重组载体。与HBX蛋白共同转染哺乳动物细胞,建立利用微孔板检测抑制HBX蛋白活性化合物的细胞模型。结果（1）对162个样品进行初筛和复筛,共筛选出21个样品TI在1～2之间,19个样品TI在2～10之间,2个化合物TI≥10。（2）黄酮类化合物No.322 TC50＞200μg/ml,对HBsAg和HBeAg分泌治疗指数分别是5.5±0.7和＜1.0。No.223的TC50＞200μg/ml,对HBsAg和HBeAg分泌治疗指数分别是4.3±0.7和＜1.0。（3）黄酮类化合物No.322、No.223在无毒浓度50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml时,观察其对HepG2.2.15细胞产生HBV DNA拷贝数的影响。当No.322在50μg/ml、25μg/ml两个浓度时HBV DNA拷贝数分别为0.7±0.6×105copy/ml,1.7±0.2×105copy/ml。当No.223在50μg/ml、25μg/ml两个浓度时HBV DNA拷贝数分别为3.9±0.6×105copy/ml,6.2±0.7×105copy/ml。（4）黄酮类化合物No.322在30μg/ml、3μg/ml、0.3μg/ml浓度时,对细胞培养上清中HBV DNA聚合酶的影响。No.322在30μg/ml浓度对HBV DNA聚合酶有抑制作用,抑制率为39.6±7.1%,大于3μg/ml浓度拉米夫定。（5）黄酮类化合物No.322对接种HepG2.2.15细胞裸鼠大剂量组乙肝病毒HBsAg,HBeAg抗原抑制率分别为45.0±12.8%,10.0±4.2%;中剂量组HBsAg抗原抑制率为18.8±8.6%。两组与模型对照组相比抗原抑制明显,但抑制率低于相同浓度拉米夫定。（6）酶切鉴定图显示:重组质粒pTAL-EnhⅠ-SEAP经限制性内切酶MluⅠ,BglⅡ双酶切,所得片断大小与插入的目的片断HBV EnhⅠ大小一致。经北京优博基因科技有限公司测序,重组质粒pTAL-EnhⅠ-SEAP分子量5249bp,其中目的片段HBV EnhⅠ434bp,载体pTAL-SEAP 4815bp,与Gene Bank中序列相吻合。结论（1）对162个样品进行次初筛和复筛确认,得出有抗乙型肝炎病毒（HBV）活性的物质共42个。（2）黄酮类化合物No.223、No.322在体外有强抗HBV作用。（3）黄酮类化合物No.223、No.322在体外对HBV DNA拷贝数有影响。No.322在无毒浓度（50μg/ml）对HBV DNA拷贝数有显著抑制作用。（4）黄酮类化合物No.322在30μg/ml浓度时,对HBV DNA聚合酶抑制明显。判断HBV DNA聚合酶是本化合物作用靶点之一。（5）黄酮类化合物No.322对接种HepG2.2.15细胞裸鼠HBsAg有抑制作用。（6）建立一种HBX蛋白药物筛选模型。基于HBX蛋白的作用特点,PCR扩增选择性激活序列——HBV EnhⅠ,插入到分泌型碱性磷酸酶（SEAP）报告基因表达载体上游,构建重组载体。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 1.试验材料
• 1.1 受试样品
• 1.2 阳性药与细胞株
• 1.3 主要试剂及配置
• 1.4 主要仪器与器材
• 2.试验方法
• 2.1 体外抗HBV活性筛选实验
• 2.2 HepG2.2.15细胞培养上清HBV DNA聚合酶的测定
• 2.3 No.322对接种HepG2.2.15细胞裸鼠HBsAg、HBeAg水平的影响
• 2.4 统计学处理
• 2.5 HBX蛋白作用的分泌型碱性磷酸酶表达质粒的构建
• 3.试验结果
• 3.1 HBsAg,HBeAg诊断试剂盒线性范围测定
• 3.2 初筛与复筛样品库化合物体外抗HBV结果
• 3.3 No.322、No.223抗HBV的研究
• 3.4 HBX蛋白作用的分泌型碱性磷酸酶表达质粒的构建
• 4.讨论
• 4.1 模型和实验方法的选择
• 4.2 黄酮类化合物抗HBV活性
• 4.3 HBV DNA聚合酶活性测定
• 4.4 接种HepG2.2.15细胞裸鼠
• 4.5 HBX蛋白表达质粒
• 4.6 展望
• 5.小结
• 6.结论
• 附图
• 致谢
• 参考文献
• 综述
• 参考文献