论文摘要
糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）是糖尿病（diabetes mellitus, DM）常见而严重的并发症,在DN发展过程中,肾脏固有细胞过度凋亡导致的细胞增殖与凋亡关系的不平衡是肾功能恶化甚至衰竭的重要机制之一。内质网（endoplasmic reticulum,ER）是细胞内蛋白合成后修饰、折叠的重要场所,对维持细胞正常功能具有重要作用。然而ER对内质网腔内的环境变化非常敏感,Ca2+的耗竭、缺血、缺氧、错误折叠及未折叠蛋白在腔内的聚集等均可干扰ER功能,继而促发内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）。ERS激活多种信号途径,以维持细胞内环境的稳定和生存,称为未折叠蛋白反应（unfolded protein response,UPR）,UPR的重要途径之一是通过上调ER中分子伴侣蛋白的表达,增强ER蛋白折叠能力。78kd-糖调节蛋白（78-kd glucose-regulated protein, GRP78）是UPR网络的中心调节蛋白,通过与内质网应激元件PKR、IRE1以及ATF6的结合抑制ERS的激活。因此早期的UPR及时有效的逆转ERS增强细胞的存活能力,是在适度ERS下细胞启动的一种适应性保护机制。但严重而持久的应激超过细胞自身修复能力,内环境稳态不能及时恢复,凋亡将是细胞的最终结局。尽管ERS介导的凋亡途径并没有完全阐明,但2个标志性蛋白（促凋亡转录因子GADDl53/CHOP的激活和位于内质网膜上的特有的caspase-12途径）已经被确认参与这个过程,称为内质网相关性死亡（ER-associated death, ERAD）途径。足细胞是肾小球内一种独特的、终末分化的上皮细胞,胞质内含有较发达的内质网和游离核糖体等细胞器,是肾小球滤过屏障的重要组成部分。近年研究显示以足细胞凋亡为主造成细胞数目减少在糖尿病的发生发展中起着重要的作用。但内质网应激引起的凋亡途径是否与糖尿病肾病中足细胞的凋亡有关尚不完全清楚。本实验拟从观察大鼠糖尿病模型肾组织及高糖培养的小鼠足细胞中凋亡程度,ERS相关蛋白的动态表达和定位入手,探讨ERS在糖尿病肾足细胞凋亡发生中的可能作用;并研究ERS与传统线粒体凋亡途径之间的关系,以便更深入的了解DM肾损伤的潜在分子机制;同时,应用特异的UPR反应诱导剂衣霉素进行预干预实验,观察靶向ERS是否能延缓或改善糖尿病肾组织及足细胞损伤的病理进展过程,为疾病治疗方案的全新设计提供新思路。方法:1大鼠糖尿病模型肾组织及高糖培养的小鼠足细胞中细胞凋亡及GRP78, GADD153/CHOP和Caspase-12的检测体内实验:雄性Wistar大鼠行右肾切除术后2w,以腹腔单剂量注射链脲佐菌素（65mg/kg）制备大鼠糖尿病模型,对照组只注射相当体积的枸橼酸盐缓冲液;48h后尾尖取血,血糖仪测定血糖,尿糖试纸测定尿糖,血糖≥16.7mmol/L,尿糖+++++++者确定为DM模型。实验期间动物自由进食、饮水,不使用胰岛素及其他降糖药物。对照组及糖尿病组于注射STZ后2w、4w、8w、12w每组取6只大鼠,收集血、尿标本用于生化指标测定;切取肾脏分别置于4%多聚甲醛（0.01mol/L PBS配制）、4%戊二醛及70%乙醇固定,用于光镜、透射电镜观察、免疫组化、TUNEL及流式细胞术检测;部分肾皮质经液氮速冻后保存于-80℃冰箱,用于Western blot检测。体外实验:1)小鼠足细胞的培养复苏细胞后,以含10%胎牛血清,100 IU/ml青霉素,100μg/ml链霉素,2-3滴小鼠γ-干扰素的DMEM-F12培养液在细胞培养室5% CO2 ,33℃CO2培养箱中保持细胞增殖状态。待细胞长满培养瓶瓶底的80%左右即可进行消化传代;传代后更换10%胎牛血清,100 U/ml青霉素,100μg/ml链霉素DMEM-F12培养液置入5% CO2,37℃CO2培养箱中培养14天,期间23天更换培养液一次,相差显微镜观察细胞形态,细胞生长速度减慢,细胞体积明显增大,向四周伸出足突诱导成熟分化后用于实验。2)小鼠足细胞分组及相关指标的检测将分化成熟的足细胞分成3组:正常糖对照组（NG）:D-葡萄糖1g/L;高糖刺激组（HG）:D-葡萄糖4.5g/L;高糖+AngⅡ刺激组（HG+AngⅡ）:D-葡萄糖4.5g/L + AngⅡ10-8mol/L。分别经细胞同步化、分组干预及刺激12、24、48、72h后收集细胞,透射电镜观察细胞超微结构改变;TUNEL法及流式细胞术检测细胞凋亡;免疫细胞化学、Western blot和RT-PCR检测GRP78、Caspase-12、GADD153/CHOP蛋白及mRNA的表达。2内质网应激预处理对大鼠糖尿病肾组织及高糖培养的足细胞凋亡中的影响及相关指标的检测体内实验:将雄性Wistar大鼠随机分为3组:正常对照组（N组）和糖尿病组（DM）和衣霉素处理组（ATM）:分为ATM1组（成膜前1w一次性腹腔注射衣霉素,0.2mg/kg）;ATM2组（成膜1w一次性腹腔注射衣霉素,0.2mg/kg）,于注射STZ后4w及12w处死动物,收集血、尿及肾组织,分别进行血、尿生化指标检测;透射电镜观察肾组织超微结构改变、TUNEL及流式细胞术检测肾组织细胞凋亡发生情况;免疫组织化学及Western blot检测肾皮质中GRP78、Caspase-12、GADD153/CHOP蛋白表达变化。体外实验:将分化成熟的小鼠足细胞分成3组:正常糖对照组（NG）:D-葡萄糖1g/L;高糖刺激组（HG）:D-葡萄糖4.5g/L;衣霉素干预组（CTM）:衣霉素0.1μg/ml+D-葡萄糖4.5g/L,分别经细胞同步化、分组干预及刺激24、72h收集细胞,透射电镜观察超微结构变化、免疫细胞化学、western blot检测GRP78、Caspase-12、GADD153/CHOP蛋白的表达。3内质网应激预处理剂衣霉素对高糖培养的足细胞中传统线粒体凋亡途径的影响及相关指标的检测将分化成熟的小鼠足细胞分成3组:正常糖对照组（NG）:D-葡萄糖1g/L、高糖刺激组（HG）:D-葡萄糖4.5g/L和衣霉素干预组（CTM）:衣霉素0.1μg/ml+D-葡萄糖4.5g/L。分别经细胞同步化、分组干预及刺激72h后收集细胞。流式细胞术检测线粒体跨膜电位;免疫细胞化学和Western blot检测足细胞中Caspase-3蛋白的表达变化;Western blot检测Cytochrome C蛋白的表达变化。结果:1内质网应激介导糖尿病大鼠肾组织固有细胞和高糖培养的小鼠足细胞的凋亡体内试验:①光镜下观察发现:糖尿病组肾小球体积增大,系膜基质增多,部分肾小管上皮细胞出现空泡变性;②透射电镜观察发现:糖尿病组肾小球基底膜不规则增厚,足细胞部分足突融合,近曲小管上皮细胞内出现大小不等的空泡。肾小管上皮细胞及足细胞内粗面内质网可见颗粒融合及脱颗粒现象,线粒体部分嵴消失,嵴膜明显融合;③TUNEL结果显示,正常对照组鲜有凋亡细胞,糖尿病组细胞凋亡数自2w起即明显增多,主要见于肾皮质肾小管上皮细胞,尤以皮髓质交界处多见,4w起肾小球内可见凋亡细胞;流式细胞术结果显示糖尿病肾组织中细胞凋亡率较对照组明显升高,且呈时间依赖性;④免疫组织化学结果:GRP78在正常对照组呈弱表达,主要定位于远端小管和集合管上皮细胞胞浆内,与之相比,糖尿病组GRP78的表达明显增强,尤以近曲小管胞浆最为显著,4周起,部分肾小球内细胞胞浆也呈阳性表达,之后表达逐渐减弱;Caspase-12正常对照组表达较弱,主要位于肾小管上皮细胞胞浆内,糖尿病组表达明显增强,近曲小管及小球固有细胞的胞浆内均可见阳性表达;GADDl53/CHOP正常组表达主要位于小管上皮的胞浆内,个别细胞核呈阳性,糖尿病组肾小管、肾小球固有细胞胞浆胞核均有表达,细胞核阳性表达的细胞主要位于近端小管上皮细胞及部分肾小球,尤其在皮髓质交界的部位,较正常对照组明显增多;⑤Western blot结果:糖尿病组GRP78自2w起表达即高于对照组,4w表达达高峰,之后随时间延长表达逐渐下降,12w基本降至正常水平;Caspase-12自4w开始表达高于对照组,并随时间延长表达逐渐增高;GADDl53/CHOP核蛋白在糖尿病组各个时间点的表达均高于对照组,8w达高峰,12w表达略下降。体外实验:①透射电镜结果显示,正常足细胞结构清晰,可见少许微绒毛、细小突起。高糖刺激下,足细胞绒毛及突起增多,细胞内可见大量空泡,线粒体及内质网未见形态学改变,高糖+AngⅡ刺激组足细胞形态学改变与高糖组大致相同;②流式细胞术及TUNEL法结果均显示:高糖刺激组细胞凋亡数明显高于对照组,而高糖+AngⅡ刺激组细胞凋亡率较高糖刺激组进一步升高,呈时间依赖性;③免疫细胞化学结果:对照组GRP78、GADDl53/CHOP、Caspase-12均有少量阳性表达,高糖刺激后,足细胞内这三种蛋白阳性表达均明显增强,高糖+AngⅡ刺激组较高糖组表达进一步增高;④Western blot结果:高糖刺激组GRP78、Caspase-12、GADDl53/CHOP表达较正常对照组增高,GRP78在24h达高峰,之后呈下降趋势,72h基本降至正常水平;Caspase-12随时间的延长表达逐渐增高,GADDl53/CHOP核蛋白表达于48h最高,72h表达略下降。高糖+AngⅡ刺激组这三者表达较高糖组进一步升高,趋势大致相同;⑤RT-PCR结果:高糖刺激组GRP78、Caspase-12、GADDl53/CHOP的mRNA水平表达较正常对照组增高,趋势与Western blot结果大致相同,高糖+AngⅡ刺激组这三者表达较高糖组进一步升高。2内质网应激预处理剂衣霉素对大鼠糖尿病肾组织及高糖培养的足细胞凋亡及相关指标的影响适宜剂量UPR诱导剂衣霉素预处理通过上调了UPR中心调解蛋白GRP78的表达,抑制了ERS相关凋亡信号途径GADDl53/CHOP、Caspase-12的激活,减少细胞的凋亡率,改善糖尿病大鼠肾损害程度及足细胞的病理形态学变化体内实验:①光镜下观察,ATM1和ATM2组组肾组织病理变化于12w时较糖尿病组有所改善;②透射电镜观察,糖尿病组改变同前所述,ATM1组和ATM2组4w时基底膜轻度增厚,足突个别融合,粗面内质网可见颗粒融合及脱颗粒现象,12w时,基底膜及足细胞足突病变较糖尿病组明显减轻,内质网形态也有明显改善,线粒体部分嵴膜融合,模糊不清;③流式细胞术及TUNEL法检测结果均显示:ATM1组和ATM2组凋亡细胞数或凋亡率明显低于糖尿病组,但仍高于正常对照组。④免疫组织化学结果:ATM1组和ATM2组GRP78的表达较糖尿病组进一步增高,GADDl53/CHOP、Caspase-12的表达于4w时与糖尿病组相比无明显差异,12w时,表达较糖尿病组有所下降,但仍高于正常对照组;⑤Western blot结果:ATM1组和ATM2组GRP78的表达较糖尿病组进一步增高,GADDl53/CHOP、Caspase-12的表达于4w时与糖尿病组相比差异无统计学意义,12w时,表达较糖尿病组有所下降,但仍高于正常对照组。体外实验:①透射电镜结果显示:CTM2组足细胞形态学改变较糖尿病组有所减轻;②流式细胞术及TUNEL法结果显示:CTM2组凋亡细胞数明显低于高糖刺激组,但仍高于正常对照组,CTM1组凋亡率与高糖刺激组相比无统计学意义,CTM3组凋亡细胞数较高糖刺激组大大增高;③免疫组织化学结果:CTM2组GRP78表达较高糖组有所增加,Caspase-12、GADDl53/CHOP表达较高糖组减弱,但均高于正常糖对照组;④Western blot结果:CTM2组GRP78于24h表达最强,之后呈下降趋势,但表达始终高于高糖刺激组。Caspase-12、GADDl53/CHOP72h时较高糖刺激组表达明显减弱。3内质网应激预处理剂衣霉素对高糖培养的足细胞传统线粒体凋亡途径相关指标的影响①足细胞线粒体膜电位（mitochondrial tranmembrane pitentials,ΔΨm）的改变:高糖刺激组较正常对照组ΔΨm明显下降,CTM刺激组较高糖对照组明显升高,但较正常对照组降低。②免疫组化结果:对照组足细胞Caspase-3有少量阳性表达,高糖刺激后,细胞内Caspase-3蛋白表达明显增强,CTM刺激组蛋白表达较高糖组显著降低。③Western blot结果:高糖刺激组Cytochrome C、Caspase-3表达较正常对照组增高,CTM刺激组蛋白表达较高糖组显著降低。结论:1糖尿病大鼠肾损害及高糖刺激对足细胞的损害过程中诱导了ERS,其相关凋亡途径参与了肾脏固有细胞凋亡,并在DN的发生发展中发挥重要作用。2适宜剂量的UPR诱导剂衣霉素预处理糖尿病大鼠及高糖培养的足细胞,显著减少了细胞的凋亡率,增强了细胞的存活能力,对组织细胞具有保护作用。但UPR是双刃剑,衣霉素的这种保护作用与它的浓度有关,过强的激活ERS,最终会导致细胞的损害直至凋亡。3低剂量ERS诱导剂衣霉素在干预内质网应激状态的同时,对线粒体功能具有一定调节作用,提示通过有效作用于内质网,发挥其介导细胞稳定性,减少凋亡,可能为疾病的治疗方案设计提供新思路。
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