论文摘要
在相对简单和人为可控的分子结构上重现生物大分子的结构与功能关系,不但可以借此探讨生物大分子的作用机制,研究生物大分子之间以及它们与小分子之间的相互作用（如,DNA/RNA-蛋白质,配体-蛋白质,酶-激动剂或拮抗剂,抗原-抗体,受体-配体等等）,还在进而开发利用这些新分子的实际应用价值,如发展研究工具和治疗药物等方面具有重要的理论和实际意义。结构决定功能,自然界中各种生物大分子特定的化学结构决定了其独特的功能表现。蛋白质的活性中心（关键性位点）是识别并发挥作用的关键部位。同一家族的酶,其催化活性中心含有性质相似或相同的功能基,他们能催化同样的化学反应类型,具有相似的作用机制。即,结构相似,功能相似,活性中心功能基的种类和空间组合决定了对底物的选择性,是产生特定功能的结构基础。如模拟酶研究中,利用一些简单的分子结构骨架来模拟酶的催化中心,发挥了与酶类似的催化作用。DNA的高级结构具有确定性、规则性和可组装性的特点,在这种规则结构上,各位点的相对空间位置具有可确定性和可预知性,因此,在不影响碱基配对的专一性和稳定性,以及保持整体螺旋构型的基础上,选择特定的位点对核酸单体修饰引入功能基,就可以将特定官能团定位在特定空间位置。理论上,通过在不同位置,选择不同的连接臂来引入所需的各种功能性官能团,就可能在DNA结构上模拟出不同生物大分子活性中心结构,并产生类似的功能。基于这样的结构特点和推论,我们课题组提出并展开了以核酸为骨架,通过在其结构上准确定位,引入一个或一组特定功能基来模拟生物大分子局部空间结构,并籍此研究生物大分子间的相互作用。本课题组前期已完成了部分主链和碱基上引入功能基的研究工作。本课题以核糖核酸酶RNase A和脱氧核糖核酸酶DNaseⅠ作为大分子模拟策略的切入点,在计算机建模设计和分子动力学模拟的指导下,对课题进行理性设计和虚拟筛选;合成一系列含所需功能基（咪唑基、氨基、羟基、羧基等）的亚磷酰胺单体;通过核酸双螺旋或三螺旋的高级结构自组装,达到在三维空间特定位置引入特定功能基,并模拟出酶活性中心三维结构的目的。以DNA为构建骨架,对于模拟核酸酶尤为合适,利用功能序列与靶序列之间的互补结合,一方面可实现对特定靶序列的专一性反应,另一方面也能保证功能基与靶位点在空间上的接近。RNase A和DNaseⅠ分别具有水解靶RNA序列和DNA序列的功能,含这些活性中心功能基的功能序列可以作为双螺旋结构的一条链,或作为三螺旋中的任何一条链或两条链,模拟RNase A和DNaseⅠ,水解与之互补的靶核酸序列。若以mRNA序列为靶,属于针对RNA的反义技术,若以相应相应疾病的双螺旋DNA序列为靶,则是一种全新的“分子剪刀”性质的新型反基因（antigene）治疗方法。这类具有具有蛋白质功能的核酸类似物,有可能成为一类重要的功能分子,具有潜在的理论研究和实际应用价值。在本课题已完成的研究中,通过计算机建模和模拟对课题进行了理性设计,为保证课题的合理性提供依据。其中,建立了一套方便快捷的螺旋建模、模拟以及新单体调用的方法。根据课题需要,设计合成了4个含咪唑功能基的核苷类似物LK-XL-001、LK-XL-002、LK-XL-003、LK-XL-004,1个含羟基功能基核苷类似物LK-XL-005,3个含氨基功能基的核苷类似物LK-XL-007、LK-XL-008、LK-XL-009,通过功能基的正交保护,最终合成了7个新亚磷酰胺单体,用于DNA固相合成。设计合成了45个功能基修饰的DNA序列,其中10个用于进行合成方法研究及理化性质评价,35个用于进行模拟酶活性评价。使用高效液相、凝胶电泳作为纯化方法,酶解实验和MALDI-TOF作为鉴定方法,证实了合成方法的有效性。应用Tm值的测定,结果表明所引入的功能基修饰对DNA高级结构的稳定性没有显著影响。在利用双螺旋结构模拟RNase A酶的研究中取得了预期的结果。共设计合成了5个功能序列（LK-XL-OP-009、LK-XL-OP-013、LK-XL-OP-009H、LK-XL-OP-013S、LK-XL-OP-013H）,其中LK-XL-OP-009和LK-XL-OP-013含氨基功能基,LK-XL-OP-013S含氨基—羟基功能基的组合,LK-XL-OP-009H和LK-XL-OP-013H含氨基—咪哗基功能基的组合。初步的研究结果发现:在含Mg2+的Tris-HCl（pH7～8）缓冲液体系和32℃的反应条件下,5个功能序列都表现出对靶RNA磷酸二酯键的高催化水解活性和位点选择性;所建立的氨基—Mg2+体系的催化效率高于已有的二氨基体系和氨基—咪唑体系。根据这个体系对pH和Mg2+的依赖性研究,推测它可能是以氨基作为路易斯碱,Mg2+作为路易斯酸的催化机制而水解靶RNA。这类带有功能基的系列寡聚核苷酸类似物,通过与靶序列形成的高级结构,成功模拟了RNase A酶的功能,但又与酶的整体高级结构形态完全不同。这一结果有力验证了本课题中以不同分子骨架来模拟局部活性结构的设计思想,并为这种设计思想的深入拓展以及发展这类新功能分子的潜在应用价值和研究其作用机理打下了基础。在利用三螺旋结构模拟DNaseⅠ酶的研究中,设计并合成了2大系列共22条功能序列,尚未获得预期结果,正在针对不同的结构和反应条件等进行进一步的探索。