Enterobacter cloacae Z0206富硒多糖的制备、结构分析及其主要生物学功能研究

论文摘要

本研究通过对从肉灵芝上分离、纯化的产多糖菌种进行了耐硒驯化,得到了产多糖耐硒菌种Z0206,并对其进行了鉴定；通过深层富硒发酵制备了富硒蛋白多糖；进一步利用现代分离纯化技术,得到富硒多糖及其主要组分,并对其结构进行了分析；通过建立环磷酰胺所致的免疫抑制小鼠模型和H202诱导的RAW264.7细胞氧化损伤模型,研究了富硒多糖的免疫调节功能和抗氧化活性及其作用机制。其主要研究结果如下：1.产多糖耐硒菌种的驯化和鉴定通过平板划线法和浓度梯度法对产多糖菌种进行了耐硒驯化,得到产多糖耐硒菌种Z0206,并运用形态学、生理生化特征和16S rDNA基因序列分析相结合的方法对其进行了鉴定。鉴定结果表明,产多糖耐硒菌种Z0206属于E.cloacae。将测序获得的16S rDNA基因序列登录GenBank,获得登录号为EU647232,并与其相似性较高的序列构建了系统发育树。2. E.cloacaeZ0206富硒多糖的制备通过发酵培养基和发酵条件的优化得到E.cloacae Z0206富硒蛋白多糖的发酵条件：采用PDA加富培养基,接种量2%,培养温度30℃,pH值7.0,转速200 rpm,培养第6h加硒,加硒浓度20μg/mL,发酵时间48h,起始葡萄糖浓度2%,第24h流加2%葡萄糖；利用优化的发酵条件进行深层富硒发酵,发酵液通过蒸发浓缩、离心、乙醇沉淀等制备得到了富硒蛋白多糖（SPPS）:产量为26.7g/L,含硒量为65.7mg/kg；进一步经Sevag结合酶法脱蛋白、H2O2脱色、透析等处理纯化得到富硒多糖（SPS）。3. E.cloacae Z0206富硒多糖的结构分析将纯化得到的富硒多糖SPS经离子交换柱层析（DEAE-52）和分离型凝胶柱层析（Sephadex G-100）分离纯化得到两个组分,其中组分1（SPS-1）占76%,采用液相色谱、红外光谱、核磁共振等对SPS-1的结构进行初步分析。结果表明,SPS-1是由葡萄糖、半乳糖和甘露糖组成的均一性杂多糖,摩尔比为8.530：0.061：0.706,分子量为23.9KD,分散系数为1.3；存在吡喃糖环构型和α、β糖甙键构型,并具有三股螺旋结构,具有较长的侧链和较多的分枝,SPS-1平均粒径为47.49nm,表面电荷为11.9mV,脱水温度85.98℃,气化温度为256.57℃。4.E.cloacae Z0206富硒多糖的免疫调节功能研究本试验通过建立坏磷酰胺所致的ICR小鼠免疫低下模型,研究了细菌E.cloacae Z0206富硒多糖对免疫低下小鼠的免疫调节作用及其作用机制。结果表明,与空白对照组相比,环磷酰胺（50mg/kg.B.W）对免疫器官重、部分细胞和体液免疫指标具有显著的抑制作用（p<0.05）,即建模成功：与环磷酰胺作用组相比,200 mg/kg和400 mg/kg的富硒蛋白多糖（SPPS）,400 mg/kg的富硒多糖（SPS）和多糖（PS）均显著提高了脾脏和胸腺指数（p<0.05）,缓解环磷酰胺引起的脾脏和胸腺萎缩,显著提高了ConA和LPS诱导的脾脏T、B淋巴细胞增殖（p<0.05）和细胞因子（IL-2、TNF-α）的mRNA水平（p<0.05）；与环磷酰胺作用组相比,400 mg/kg的SPPS和SPS预防性灌胃后,血清和细胞培养液中IL-2和TNF-α水平显著升高（p<0.05）,400 mg/kg的PS和200 mg/kg的SPPS提高了血清中TNF-α水平、培养液中IL-2和TNF-α的水平（p<0.05）；400mg/kg的SPPS、SPS和PS预防组的CD4+、CD4+/CD8+和NK细胞活性均显著高于环磷酰胺组（p<0.05）,CD8+细胞活性显著低于环磷酰胺组（p<0.05）,其中400mg/kg的SPPS组使其恢复到正常水平；200 mg/kg的SPPS,400 mg/kg的SPPS、SPS和PS显著提高了免疫低下小鼠血清溶血素水平（p<0.05）和抗体形成细胞数（p<0.05）,其中经400mg/kg的SPPS灌胃预防均可使血清溶血素半数溶血值和抗体形成细胞数目恢复到正常水平。从其作用效果来看：富硒蛋白多糖>富硒多糖>多糖。提示：富硒多糖可通过调节细胞免疫和体液免疫,而发挥的免疫调节作用；硒、蛋白和多糖三组分在发挥免疫调节作用方面可能具有较强的协同作用。5. E.cloacae Z0206富硒多糖的抗氧化活性研究本试验通过建立H2O2诱导小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞氧化损伤模型,研究了细菌E.cloacae Z0206富硒多糖对RAW264.7细胞氧化损伤的保护作用及其作用机制。结果表明,与对照组相比,H2O2显著降低RAW264.7细胞的存活率（p<0.05）：与H2O2单独作用组相比,200μg/ml和400μg/ml的富硒蛋白多糖（SPPS）,400μg/ml的富硒多糖（SPS）和多糖（PS）显著提高了SOD和GSH-Px活性,抑制ROS、MDA的产生和LDH的释放,维持细胞线粒体膜的完整性,抑制跨膜电位的耗散、Caspase-3的活化和DNA的降解（p<0.05）：与H2O2单独处理组相比,不同浓度的（200μg/ml和400μg/ml）的SPPS和SPS,400μg/ml的PS显著提高了Bcl-2基因的mRNA水平（p<0.05）,降低了Bax基因的mRNA表达水平（p<0.05）；与H2O2单独处理组相比,SPPS （200μg/ml）和SPS（400μg/ml）显著增加了Bcl-2基因的蛋白表达水平和Bcl-2/Bax（p<0.05）,降低了Bax基因的蛋白表达水平,PS （400μg/ml）显著提高了Bcl-2基因的蛋白表达水平（p<0.05）；与H2O2作用组相比,200μg/ml和400μg/ml的SPPS、SPS和PS均显著提高了血红素氧化酶（HO-1）的mRNA和蛋白表达水平。从抗氧化效果来看：富硒蛋白多糖>富硒多糖>多糖；对于SPPS,浓度过高,其抗氧化活性显著下降,而SPS和PS则表现出明显的量效关系。提示：富硒蛋白多糖和富硒多糖可能通过清除活性氧,提高抗氧化酶活性、诱导HO-1的表达以及抑制凋亡信号通路而对H2O2引起的RAW264.7细胞的氧化损伤实施保护作用,是一种有效的抗氧化剂；硒、蛋白和多糖三组分可能在发挥抗氧化功能方面具有较强的协同作用。

论文目录

• 致谢
• 前言
• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 第一节 肉灵芝的研究概况
• 1.1 肉灵芝简介
• 1.2 肉灵芝的形态特征
• 1.3 肉灵芝的研究及开发应用价值
• 第二节 细菌胞外多糖的研究进展
• 2.1 细菌胞外多糖的性质
• 2.2 细菌胞外多糖的功能
• 2.3 细菌胞外多糖的生物合成
• 2.4 细菌胞外多糖的发酵
• 2.5 细菌胞外多糖的生物学活性
• 2.6 细菌胞外多糖的开发应用前景
• 第三节 微生物富硒多糖的研究进展
• 3.1 微量元素硒的生物学功能及其作用规律
• 3.2 微量元素硒的微生物转化及其研究现状
• 3.3 富硒多糖的来源与结构
• 3.4 富硒多糖的生物学活性及其应用
• 3.5 富硒多糖的开发应用前景展望
• 第四节 活性多糖的作用机制
• 4.1 多糖作用的受体
• 4.2 细胞信息传导
• 4.3 多糖对基因表达的影响
• 第五节 活性多糖的构效关系
• 5.1 单糖组成
• 5.2 糖苷键类型
• 5.3 溶解度和粘度
• 5.4 取代基
• 5.5 分子量
• 5.6 核心寡糖片段
• 5.7 高级结构
• 第六节 本研究的目的、意义和研究内容
• 6.1 本研究的目的和意义
• 6.2 研究内容
• 第二章 产多糖耐硒菌种的驯化和鉴定
• 摘要
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.2 试验方法
• 3 结果与讨论
• 3.1 产多糖耐硒菌种的驯化
• 3.2 产多糖耐硒菌种Z0206的形态观察
• 3.3 产多糖耐硒菌种Z0206的生理生化特征
• 3.4 16SrDNA的PCR扩增和序列测定
• 3.5 产多糖耐硒菌种Z0206的系统发育分析
• 4 小结
• 第三章 Enterobacter cloacae Z0206富硒多糖的制备
• 摘要
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.2 试验方法
• 3 结果与分析
• 3.1 发酵培养基的筛选
• 3.2 富硒多糖发酵条件的优化
• 3.3 葡萄糖用量的优化
• 3.4 富硒试验研究
• 3.5 制备得到富硒多糖
• 3.6 蛋白、多糖和有机硒含量的测定
• 4 小结
• 第四章 Enterobacter cloacae Z0206富硒多糖的结构分析
• 摘要
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.2 试验方法
• 3 结果与讨论
• 3.1 富硒多糖的分级纯化
• 3.2 纯度鉴定
• 3.3 分子量的测定
• 3.4 HPLC检测单糖组成
• 3.5 红外光谱分析
• 3.6 核磁共振氢谱及碳谱分析
• 3.7 碘-碘化钾反应
• 3.8 刚果红试验
• 3.9 原子力显微镜观察多糖分子形貌
• 3.10 粒径与表面电荷分析
• 3.11 X-射线衍射仪测定结晶性能
• 3.12 差示扫描量热仪测定热特性
• 4 小结
• 第五章 Enterobacter cloacae Z0206富硒多糖的免疫功能的调节作用研究
• 摘要
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.2 试验方法
• 3 结果与分析
• 3.1 富硒多糖对小鼠免疫器官重量的影响
• 3.2 富硒多糖对小鼠组织形态学变化的影响
• 3.3 富硒多糖对小鼠淋巴细胞增殖的影响
• 3.4 富硒多糖对小鼠细胞因子mRNA水平的影响
• 3.5 富硒多糖对细胞因子水平的影响
• 3.6 富硒多糖对T细胞亚群和NK细胞活性的影响
• 3.7 富硒多糖对小鼠体液免疫的影响
• 4 讨论
• 5 小结
• 第六章 Enterobacter cloacae Z0206富硒多糖的抗氧化活性研究
• 摘要
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.2 试验方法
• 3 结果与分析
• 3.1 细胞培养和细胞存活率的检测
• 3.2 吖啶橙荧光染色观察细胞形态
• 2O₂诱导的RAW264.7细胞凋亡的影响'>3.3 富硒多糖对H₂O₂诱导的RAW264.7细胞凋亡的影响
• 3.4 富硒多糖对RAW264.7细胞DNA降解的影响
• 3.5 SOD和GSH-Px活性、MDA含量和LDH释放率的测定
• 3.6 活性氧（ROS）含量测定
• 3.7 Caspase-3活性检测
• 3.8 流式细胞仪检测线粒体膜电位（△ΨM）
• 3.9 H0-1基因的mRNA和蛋白表达水平分析
• 3.10 Bcl-2和Bax的mRNA和蛋白表达水平分析
• 4 讨论
• 5 小结
• 小结
• 创新点
• 后续研究展望
• 参考文献
• 作者简历