支原体荧光定量PCR快速检测方法的建立及应用

论文摘要

目的:建立Taqman探针法支原体荧光定量PCR检测技术,检测人、动物中相关支原体及细胞培养物中常见支原体。方法:利用支原体通用引物GPO3及MGSO从支原体基因组DNA中扩增出288bp的片段,然后将该片段连接T载体克隆扩增,将其作为标准质粒。从12种支原体的16SrRNA核酸序列中选择了三段高度保守的核酸序列,分别作为支原体通用引物及其相应Taqman探针。构建了荧光定量PCR绝对定量的标准品,并对反应体系进行优化,建立绝对定量的标准曲线。利用十倍稀释法检验荧光定量方法的灵敏度并与普通PCR法进行比较;特异性检验后进行标本的检验。在标本检验中比较荧光定量PCR法同普通PCR法、培养法的灵敏度差异。结果:本实验成功的在支原体16SrRNA区域设计了支原体通用引物及探针,构建了猪鼻支原体绝对定量的参照质粒,标准曲线相关系数为0.99232。支原体荧光定量PCR检测反应的灵敏度为10copy/反应管为普通PCR的100倍。组内及组间重复性好。荧光定量PCR法检测样本灵敏度明显高于普通PCR法及培养法。结论:实验结果证明本实验所构建的荧光定量PCR法可快速检测支原体,特异性强、灵敏度高,稳定性好,可用于检测实验室样本及临床样本。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 序论
• 1 定义
• 2 FQ-PCR 的理论依据
• 3 FQ-PCR 的理论模式
• 4 FQ-PCR 主要原理及分类
• 5 FQ-PCR 技术与传统定量 PCR 技术的区别
• 6 Taq Man 法 FQ-PCR 技术引物探针设计原则
• 本论
• 第一部分 支原体荧光定量PCR 快速检测方法的建立及应用
• 引言
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 第二部分 支原体荧光定量PCR 检测方法的应用及与其它检测方法的比较
• 引言
• 1 普通PCR 及荧光定量PCR 法检测样本中支原体
• 1.1 材料与方法
• 1.2 检测结果
• 1.3 FQ-PCR 与常规 PCR 准确性鉴定
• 2 培养法检测样本中支原体
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 综述
• 综述参考文献
• 英文缩写词表（Abbreviation）
• 致谢