沃尼妙林的抗炎作用及对炎症信号转导通路的调控

论文摘要

一些抗生素除了具有抗菌作用外,还被报道在体外具有调节免疫应答的作用。沃尼妙林是新一代广谱的截短侧耳素类半合成抗生素,对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、厌氧菌、支原体以及螺旋体均有效。临床上常被用来治疗猪的肠道疾病和急性多关节炎,以及猪和禽类的地方性肺炎。也被用在人类医学中耐药支原体感染的治疗。但目前该药仅作为抗菌剂在临床上应用,为了充分发挥沃尼妙林的药用价值,进一步扩大该药在临床上的应用范围,本研究利用LPS刺激小鼠RAW 264.7单核-巨噬细胞建立的体外炎症反应,研究沃尼妙林的体外抗炎活性,并在此基础上借助炎性信号传导通路平台进一步探索它的分子抗炎作用机制。同时构建LPS所致小鼠急性肺损伤（ALI）模型和内毒素性休克模型,检测沃尼妙林对两种动物模型的保护作用。巨噬细胞在特异性和非特异性炎症过程中都起到决定性作用。用脂多糖（LPS）活化巨噬细胞常用于评价众多药物的抗炎活性。LPS活化的巨噬细胞会分泌多种细胞因子,例如肿瘤坏死因子α（TNF-α）,白细胞介素1p（IL-1p）,白细胞介素6（IL-6）和白细胞介素10（IL-10）等；还可产生多种炎性介质,如一氧化氮（NO）和前列腺素E2（PGE2）等。大量产生这些细胞因子和炎性介质能够导致全身性炎症反应综合症（SIRS）、严重的组织损伤,甚至内毒素性休克。因此,本试验首先通过建立LPS诱导的小鼠单核-巨噬细胞RAW 264.7的体外炎症模型,研究了不同浓度沃尼妙林对RAW 264.7细胞的细胞因子TNF-α、IL-1β,IL-6和IL-10及炎性介质NO和PGE2分泌的影响。结果显示沃尼妙林剂量依赖的抑制了TNF-α、IL-6的分泌,提高了IL-10的水平,抑制了NO和PGE2的合成,但对IL-1β的作用不显著。这表明,沃尼妙林有可能通过调节细胞因子和炎性介质的分泌而发挥抗炎作用。LPS诱导细胞因子及炎性介质产生的机制已被深入研究,其中最常见的两条信号传导通路NF-κB和MAPKs起了关键作用。因为它们常被作为抗炎分子机制的重要靶位。本实验通过用LPS刺激小鼠的RAW 264.7细胞,测定沃尼妙林对NF-κB和MAPKs信号传导通路的影响,从而探究沃尼妙林抗炎分子机制。结果显示沃尼妙林显著抑制了LPS刺激的小鼠RAW 264.7巨噬细胞NF-κB的活力,同时显著抑制了LPS刺激的小鼠RAW 264.7巨噬细胞ERK、JNK和p38 MAPKs蛋白表达,作用呈剂量依赖方式。这说明,沃尼妙林通过调控NF-κB、ERK、JNK和p38 MAPKs通路而抑制细胞因子TNF-α、IL-6和炎性介质NO、PGE2合成。为了对沃尼妙林的临床疗效提供客观的评价指标,我们进一步验证了沃尼妙林在体内的抗炎作用。通过LPS诱导建立了急性炎症肺损伤模型,来研究预服用沃尼妙林（100 mg/kg）对急性肺损伤的作用。制备支气管肺泡灌洗液以检测蛋白浓度、细胞因子水平以及超氧化物歧化酶（SOD）的活性；收集肺组织以测定湿干重（W/D）比率、髓过氧化物酶（MPO）活性、炎性细胞因子mRNA的表达和观察组织学的变化。结果显示,预服用沃尼妙林显著的降低了肺的W/D比率、蛋白浓度和总白细胞数以及中性粒细胞数、巨噬细胞数、淋巴细胞数,并且组织学分析表明沃尼妙林明显的减弱了组织损伤。此外,沃尼妙林还显著的增大了支气管肺泡灌洗液中的SOD的活性,同时很好的减弱了肺中MPO的活性,这与对中性粒细胞浸润的影响一致。而且沃尼妙林还抑制了TNF-α、IL-6和IL-1β等炎性细胞因子的产生,这个结果与肺组织中mRNA的表达结果一致。这些结果表明,沃尼妙林对LPS诱导的急性炎症肺损伤小鼠模型具有保护作用。还通过构建LPS诱导的小鼠内毒素性休克模型,研究了不同浓度沃尼妙林对小鼠的预防和治疗作用及对小鼠血清中早期细胞因子TNF-α,IL-1β,IL-6和IL-10合成的影响。实验结果显示,沃尼妙林有效的改善了内毒素性休克小鼠的生存率；显著的降低了小鼠血清中TNF-α、IL-6的合成,提高了IL-10的水平,但对IL-1β作用不显著。表明沃尼妙林通过调节细胞因子水平提高了LPS所致内毒血症小鼠的生存率。本研究为沃尼妙林在临床上的合理应用提供了理论依据,提高其在兽医临床上的应用价值,同时使得该药物对由于单核-巨噬细胞等的过度激活导致的过度炎症反应,以及SIRS和MODS的防治具有重要意义。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 英文缩写词表
• 前言
• 第一篇 文献综述
• 第一章 抗生素的抗炎作用
• 1.1 抗生素的抗炎活性概述
• 1.2 抗生素的抗炎作用机制研究概况
• 1.3 对细胞因子的影响
• 1.4 结语
• 第二章 脂多糖诱导的炎症信号传导通路的研究进展
• 2.1 LPS
• 2.2 LPS受体
• 2.3 LPS介导的细胞内信号转导通路
• 第三章 沃尼妙林研究进展
• 3.1 沃尼妙林概况
• 3.2 理化性质
• 3.3 抗菌作用机理及其活性
• 3.4 药代动力学
• 3.5 残留消除研究
• 3.6 毒性
• 3.7 配伍与禁忌
• 3.8 临床应用
• 3.9 制剂
• 第四章 急性肺损伤研究进展
• 4.1 急性肺损伤研究进展
• 4.2 急性肺损伤治疗进展
• 第五章 内毒素性休克研究进展
• 5.1 内毒素性休克对机体的影响
• 5.2 内毒素性休克免疫治疗
• 第二篇 实验研究
• 第一章 沃尼妙林对LPS诱导的细胞因子和炎性介质分泌的影响
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.3 结果
• 1.4 讨论
• 第二章 沃尼妙林对炎性信号转导通路的调控
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 第三章 沃尼妙林对脂多糖诱导急性肺损伤小鼠的保护作用
• 3.1 LPS诱导的ALI小鼠模型的建立及沃尼妙林对模型的影响
• 3.2 沃尼妙林对LPS诱导的ALI小鼠模型炎性细胞因子的影响
• 3.3 沃尼妙林对LPS诱导的ALI小鼠模型两种酶活性的影响
• 3.4 沃尼妙林对LPS诱导的ALI小鼠模型模型作用的病理学分析
• 3.5 小结
• 第四章 沃尼妙林对内毒素性休克小鼠的保护作用
• 4.1 材料
• 4.2 方法
• 4.3 结果
• 4.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 导师简介
• 作者简介
• 致谢