论文摘要
目的A型土拉热弗朗西斯氏菌（Francisella tularensis）是一种革兰氏阴性专属细胞内细菌,也是导致兔热病（tularemia）的病原体,可以引起哺乳动物包括人类的全身性感染。如果不予以治疗,毒性A型土拉热弗朗西斯氏菌,尤其是气溶胶型的病原体,很容易导致人类的致死性感染。10个毒性A型细菌就可导致严重的疾病,而且偶然的或者有预谋的污染水和食物也是一种引发感染的替代方法。因此,A型土拉热弗朗西斯氏菌被看作是生物战争武器。尽管它的临床和生物安全性都很重要,但是对A型土拉热弗朗西斯氏菌感染,特别是通过呼吸道和消化道引起的感染的免疫发病机理和分子机制目前尚不清楚。淋巴毒素又称TNF-β,与TNF-α是两个密切相关的细胞因子,同属TNF家族。根据TNF来源的不同,人们将单核/巨噬细胞所产生的TNF称为TNF-α;把T细胞产生的TNF称为TNF-β,或称为淋巴毒素（LT）。膜结合的淋巴毒素以LT-α和LT-β亚单位结合形成的异源三聚体复合物形式分布在细胞膜上,与LT-β受体结合,在外周淋巴器官发生形成中起作用。分泌到细胞外的可溶性的LT-α通过TNF受体传导通路激活各种炎性细胞因子和趋化性细胞因子。LT与TNF及LT相关的可诱导配合体LIGHT形成一个完整的信号网络,这个信号网络对调节先天性和获得性免疫应答都有很重要的作用。在这点上,LT-α参与宿主防御许多细菌、病毒和寄生性病原体的作用已经被认同。本研究的目的一是为了阐明在不同途径（吸入和经口）及不同剂量感染的情况下,LT-α在宿主防御A型土拉热弗朗西斯氏菌中所起的作用;二是观察小鼠在无外周淋巴结的情况下被细菌感染后是否能够存活及清除病原菌,并观察缺乏淋巴结的小鼠是否能够阻止或延迟细菌到其他组织的播散;三是观察吸入感染A型土拉热弗朗西斯氏菌对胸腺和胸腺细胞的影响与其作用机制以及胸腺在兔热病发病过程中的作用;四是观察经口感染不同剂量A型土拉热弗朗西斯氏菌后免疫活性小鼠和免疫缺陷小鼠的易感性、感染过程的特征以及相关的宿主反应。方法1实验动物与感染方法C57BL/6小鼠,BALB/C小鼠,B6.129S2-Ltαtm1Dch/J（LT-α-/-）小鼠,B6.129S7-Ifngtm1 Agt（IFN-γ-/-）小鼠,B6;129S-Tnfrsflatm1 ImxTnfrsflbtm1 Imx（TNFR1R2-/-）小鼠以及胸腺切除小鼠。菌株:FSC033/SnMF,A型,原始分离于美国的一只松鼠体内,本实验室保种于-80℃冰箱中。吸入感染时,解冻A型土拉热弗朗西斯氏菌贮存株,用含20%（V/V）甘油的Mueller Hinton肉汤稀释以保持其感染性。气溶胶型的A型土拉热弗朗西斯氏菌由Lovelace喷雾器产生。操作定在40psi的压力下,小鼠暴露在这个气溶胶环境中7min,导致约10个细菌进入肺中。经口感染时,用PBS稀释A型土拉热弗朗西斯氏菌,用18-gauge填喂针给予每只小鼠0.5ml菌液,实际的细菌数用培养皿法确定。2 LT-α在抵抗土拉热弗朗西斯氏菌吸入感染过程中的作用LT-α-/-和对照组C57BL/6（LT-α+/+）小鼠吸入感染小剂量（吸入约10个细菌）A型土拉热弗朗西斯氏菌,监测它们的存活情况和死亡时间。为了研究感染的病原体的剂量大小是否对LT-α控制呼吸感染产生影响,LT-α-/-和C57BL/6小鼠吸入不同剂量（10,100,1000 cfu/只）A型土拉热弗朗西斯氏菌,同时监测它们的生存情况,记录死亡时间。为了研究LT-α在机体抵抗吸入感染小剂量A型土拉热弗朗西斯氏菌过程中的作用及相关的宿主反应,取实验组LT-α-/-小鼠和对照组C57BL/6小鼠吸入感染小剂量A型土拉热弗朗西斯氏菌,分别编号称重。在感染细菌后0d,2d和4d处死小鼠。通过肉眼观察,证实LT-α缺陷小鼠很明显地缺乏外周淋巴结。用精确度为0.1mg的天平称重,称量每只小鼠的体重和胸腺的重量,结果以胸腺重量指数表示,即胸腺重量（g）比小鼠体重（g）×100。为了进一步估计A型土拉热弗朗西斯氏菌感染对胸腺细胞的影响,我们将分离出的胸腺放在冷的PBS中,挤压胸腺通过75μm孔径的一次性细胞滤网中,再用大口吸管反复吹打,分离单个细胞,用血细胞计数池计数每只小鼠的胸腺细胞总数。同时收集支气管肺泡灌洗液,计数细胞总数并进行白细胞分类计数,用来确定在感染后2d和4d是否有大量炎性细胞流入肺中。收集血样和支气管肺泡灌洗液,用于测定血清和支气管肺泡灌洗液的21种细胞因子和趋化性细胞因子水平和血清中10种临床生化指标。将肺、脾、肝和胸腺取出,用于定量细菌学分析和组织病理学分析。3胸腺损伤与兔热病的相关性观察取进行胸腺切除术的C57BL/6小鼠作为试验组,另外一组C57BL/6小鼠作为对照组。小剂量吸入感染A型土拉热弗朗西斯氏菌,然后记录这两组小鼠的死亡率和半数死亡时间。为了探索TNF与吸入感染引起的胸腺损伤的相关性,再取一组C57BL/6小鼠作为对照组,取TNFR1R2-/-小鼠作为实验组,吸入感染小剂量A型土拉热弗朗西斯氏菌。在感染后4d,测定胸腺重量指数和每只小鼠的胸腺细胞总数。用RPMI 1640细胞培养液体外培养胸腺细胞,用A型土拉热弗朗西斯氏菌感染,在不同时间点观察细胞的存活情况,用这个体外实验来进一步观察A型土拉热弗朗西斯氏菌对胸腺细胞的影响在体内和体外实验中是否一致。4 LT-α在抵抗土拉热弗朗西斯氏菌经口感染过程中的作用取C57BL/6小鼠、BALB/C小鼠、LT-α-/-小鼠,经口给予不同数量的A型土拉热弗朗西斯氏菌（C57BL/6小鼠和BALB/C小鼠的感染剂量为104～108CFU,LT-α-/-小鼠的感染剂量为104～106CFU）,感染后观察14d,纪录生存情况和半数死亡时间,计算存活率。为了排除胃酸对细菌的影响,另外取C57BL/6小鼠和BALB/C小鼠在进行实验前禁食一夜,在经口感染前用3%的碳酸氢钠中和胃酸,经口给予不同数量的A型土拉热弗朗西斯氏菌（104～108CFU）,观察14d,纪录生存情况和半数死亡时间,计算存活率。为了探索免疫缺陷小鼠对经口感染A型土拉热弗朗西斯氏菌的易感性,取LT-α-/-、IFN-γ-/-和TNFR1R2-/-三种免疫缺陷小鼠及对照组C57BL/6小鼠,经口感染5×105CFU的A型土拉热弗朗西斯氏菌。观察14d,记录它们的存活率及半数死亡时间。14d后处死依然存活的C57BL/6小鼠和LT-α-/-小鼠,取出肠系膜淋巴结（LT-α-/-小鼠除外）和脾,进行组织细菌定量分析。为了观察经口感染大剂量A型土拉热弗朗西斯氏菌能否增强免疫缺陷小鼠的易感性,另取上述试验组和对照组小鼠,经口感染5×107CFU的菌量,观察小鼠的存活率及半数死亡时间。为了探索经口感染引起的兔热病的发病过程和免疫机制,经口给予C57BL/6小鼠和LT-α-/-小鼠5×105CFU,C57BL/6小鼠5×107CFU A型土拉热弗朗西斯氏菌,分别在感染后0、2、4d和0、2、3d处死小鼠,采血分离血清进行细胞因子和趋化性细胞因子的分析;同时进行细菌定量分析,检测肺、肠系膜淋巴结（LT-α-/-小鼠除外）、脾中的细菌量以及进行肺和脾的组织病理学分析。5统计学处理各组中所有的数据都以平均数士标准差的形式表示,定量变量参数检验用t检验或单因素或双因素方差分析,然后再做各组间的两两比较。分类变量用Fisher精确检验和卡方检验。检验水平为α=0.05。结果1小鼠吸入感染后的存活时间年龄和性别匹配的22只实验组LT-α-/-和14只对照组C57BL/6（LT-α+/+）小鼠吸入感染小剂量气溶胶型A型土拉热弗朗西斯氏菌后,除了2只LT-α-/-小鼠和1只LT-α+/+小鼠外,所有的小鼠都在4-7d时死亡,死亡时间中位数为5d（LT-α-/-小鼠4-6d,LT-α+/+小鼠5-7d,P>0.05）。LT-α-/-和LT-α+/+小鼠吸入感染不同剂量（10,100,1000 cfu/只）后,虽然感染细菌数不同,但不论试验组还是对照组,感染后小鼠的死亡时间都是5d,试验组和对照组间的差异无统计学意义。2小鼠吸入感染后胸腺和胸腺细胞的变化LT-α+/+小鼠和LT-α-/-小鼠吸入感染小剂量A型土拉热弗朗西斯氏菌,两组小鼠体重在感染后2d几乎都没有变化,胸腺体积轻微降低。胸腺体重指数轻微降低。LT-α+/+小鼠胸腺细胞的总数也降低了约35%,但与0d组相比及两种小鼠间相比,差异无统计学意义。在感染后4d两种小鼠体重都出现中等程度的降低,胸腺体积显著降低。一般在死前24h左右,胸腺出现萎缩。C57BL/6小鼠胸腺体重指数严重降低,胸腺细胞的总数也降低了约85%,两者与0d组的差异均有统计学意义。LT-α-/-小鼠在感染后4d胸腺体重指数降低,胸腺细胞的总数也降低了约30%。与C57BL/6小鼠相比,两者的差异无统计学意义,与0d组的差异有统计学意义。TNFR1R2-/-小鼠体重和胸腺体积在感染后4d后均未出现变化。其胸腺重量指数和胸腺细胞数量与C57BL/6小鼠组的差异有统计学意义。3小鼠吸入感染后不同器官内的细菌定量分析在吸入感染小剂量A型土拉热弗朗西斯氏菌后2d,LT-α+/+小鼠和LT-α-/-小鼠都在组织中发现大量的细菌。但在作为原发感染灶的肺内,两组小鼠的细菌数差异无统计学意义。在LT-α-/-小鼠的脾内,细菌数却比LT-α+/+小鼠脾内细菌数低大约1到1.5对数倍（P<0.05）。在感染后4d,LT-α-/-小鼠的肺内又比LT-α+/+小鼠肺内高出10倍的细菌数（P<0.05）。在LT-α-/-小鼠的脾内细菌数也高,但与LT-α+/+小鼠相比,其差异无统计学意义。在小鼠的胸腺组织内,感染后4d发现大量A型土拉热弗朗西斯氏菌,而且LT-α-/-小鼠的胸腺组织内的细菌数比LT-α+/+小鼠的高出10倍,两组间的差异有统计学意义（P<0.05）。细菌数的差异经过3次完全独立的实验始终存在,重复性很好。4小鼠吸入感染后的病理、生化及细胞因子的变化在吸入感染小剂量A型土拉热弗朗西斯氏菌后2d,两种小鼠的肝和脾组织都显示中等程度的炎性渗出。同时出现轻微的、局部的支气管炎。在感染后4d,出现严重的坏死性肝炎和脾的淋巴滤泡破坏及支气管炎。但是吸入感染小剂量A型土拉热弗朗西斯氏菌的两组小鼠在组织病理学的改变方面没有差异。LT-α-/-小鼠和LT-α+/+小鼠在血液临床生物化学指标方面（包括总蛋白、白蛋白、球蛋白、白/球比率、胆红素、天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、葡萄糖、尿素、肌酸酐）、支气管肺泡灌洗液的细胞总数、白细胞分类计数方面的差异均无统计学意义。吸入感染后2d和4d的LT-α-/-和LT-α+/+两组小鼠的支气管肺泡灌洗液和血清中21种细胞因子和趋化性细胞因子（包括GM-CSF、IFN-γ、IL-10、IL-12（p40）、IL-12（p70）、IL-13、IL-17、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、KC、MCP-1、MCP-1β、RANTES、TNF-α、VEGF）水平都仅有小的变化。其中吸入感染A型土拉热弗朗西斯氏菌后2d支气管肺泡灌洗液中出现MCP-1的大辐度增长和KC的中等程度增长。在感染后4d,支气管肺泡灌洗液中和血清中都出现IFN-γ、IL-6、KC和MCP-1的大辐度增长;但在实验组和对照组之间的差异无统计学意义,其中唯一的例外是在LT-α-/-小鼠的支气管肺泡灌洗液中的IL-6明显高于LT-α+/+小鼠支气管肺泡灌洗液中的IL-6。5胸腺损伤与兔热病的临床相关性进行胸腺切除术的C57BL/6小鼠和对照组C57BL/6小鼠在感染后4d开始出现死亡,在5d超过半数死亡,6d时全部死亡。平均死亡时间都是5d。两组死亡率和死亡时间的差异都无统计学意义。体外培养的胸腺细胞贴壁生长良好,显示A型土拉热弗朗西斯氏菌没有导致体外培养的胸腺细胞萎缩死亡。6小鼠经口感染A型土拉热弗朗西斯氏菌半数致死量与对胃酸的抵抗力经口感染C57BL/6小鼠和BALB/C小鼠（104-108CFU）,LT-α-/-小鼠（104-106CFU）A型土拉热弗朗西斯氏菌,半数致死量为106CFU。LT-α-/-小鼠未显示出强的易感性。将实验小鼠中和胃酸后重复做相同实验,与未中和胃酸的小鼠的实验结果相同,未增强易感性。而且经过体外实验,发现A型土拉热弗朗西斯氏菌在体外对酸有相当强的抵抗力。7免疫低下小鼠对A型土拉热弗朗西斯氏菌的易感性免疫低下小鼠LT-α-/-、IFN-γ-/-和TNFR1R2-/-小鼠及对照C57BL/6小鼠经口感染5×105的A型土拉热弗朗西斯氏菌后,免疫低下小鼠显示出与正常小鼠相同的易感性。感染后14d没有死亡的C57BL/6小鼠和LT-α-/-小鼠肠系膜淋巴结(LT-α-/-小鼠除外)和脾组织中,都没有培养出A型土拉热弗朗西斯氏菌。当经口感染大剂量5×107CFUA型土拉热弗朗西斯氏菌时,免疫低下小鼠比对照小鼠显示出更高的易感性。8小鼠吸入感染后不同器官内的细菌定量分析LT-α+/+小鼠在经口感染5×105CFUA型土拉热弗朗西斯氏菌后2d,在肺中几乎没有发现细菌,仅一只小鼠脾中细菌数高达105。在感染后4d,肺中细菌数还是很少,在脾中的细菌数增高。LT-α-/-小鼠在感染后2d,肺和脾中细菌数较LT-α+/+小鼠高,在感染后4d,肺中细菌数变化不大,但有一只高达107,在脾中的细菌数增高较多。但两种小鼠间和不同感染天数间的差异都无统计学意义。说明在这个感染剂量,LT-α-/-小鼠没有表现出高的易感性。LT-α+/+小鼠在感染5×107 CFU A型土拉热弗朗西斯氏菌后2d,肠系膜淋巴结中的细菌数增高,在3d时已经低到了检测不出来的程度。感染后2d肺组织内细菌量仍然很低,但有一只高达106。在3d后发现很少量的增高。在感染后2d脾内细菌数大增,在感染后3d达高峰。9小鼠经口感染后的血清细胞因子和趋化性细胞因子的变化C57BL/6小鼠和LT-α-/-小鼠经口感染5×105CFUA型土拉热弗朗西斯氏菌后2d,血清中IFN-γ,IL-6,TNF-α,IL-12,IP-10显著增高;KC,MIP-1α,IL-1β,MIG,MCP-1和IL-10水平中等程度增高。在感染后4d,IL-6和MCP-1增高更多,其余因子维持在2d的水平。IL-2,IL-4和IL-5这3种细胞因子在感染后始终无明显变化。除了在感染后2d,LT-α-/-小鼠KC水平显著低于LT-α+/+小鼠;在感染后4d,LT-α-/-小鼠的TNF-α和MCP-1水平显著高于LT-α+/+小鼠,其余两组间的细胞因子和趋化性细胞因子的水平差异无统计学意义。C57BL/6小鼠经口感染5×107CFUA型土拉热弗朗西斯氏菌后,首先出现在肠系膜淋巴结上,然后迅速的转移到肝和脾。在那里细菌大量繁殖达到很高的细菌量,同时引起显著的嗜中性细胞的渗透聚集和严重的组织坏死。在感染后3d,在脾的红髓和白髓边缘区出现中性粒细胞和坏死淋巴细胞的大量聚集,淋巴滤泡结构破坏。肺中仅出现少量中性粒细胞聚集。受感染的C57BL/6小鼠血清中的细胞因子和趋化性细胞因子水平迅速提高;在感染后2d,IFN-γ,IL-1β,IL-6,TNF-α,MIP-1α,IP-10,MCP-1,MIG,,KC和IL-10等等出现升高趋势。在感染后3d,IL-6和MCP-1升高更多。结论1 LT-α对吸入感染小剂量A型土拉热弗朗西斯氏菌后,小鼠的死亡率和死亡时间不产生显著影响。吸入感染不同剂量该菌对小鼠死亡率和死亡时间无影响。2吸入感染该菌可导致小鼠严重的胸腺萎缩和胸腺细胞死亡,但胸腺切除的小鼠未显示出高的死亡率和死亡时间。该菌未导致体外培养的胸腺细胞萎缩死亡。TNF受体在与该菌感染相关的胸腺萎缩过程中起一定作用。3经口感染该菌的小鼠的半数致死量为106CFU;中和胃酸后未增强小鼠的易感性,体外实验发现该菌对酸有较强的抵抗力。4经口感染低剂量该菌时,免疫低下小鼠与免疫正常小鼠易感性相同;大剂量感染时免疫低下小鼠显示出更高的易感性。5 IFN-γ在机体抵抗经口感染该菌的过程中起到了一个微妙的,双面的作用。6胃肠道与肺仅作为此菌的进口,而不是感染的重要部位。全身性的感染比肺部和胃肠道的感染更易导致小鼠死亡,毒性的关键在于在机体器官中的传播和快速的细菌复制。7 LT-α在A型土拉热弗朗西斯氏菌由肺到脾、胸腺的分布过程中及后来病原体在肺、脾和胸腺中的复制方面起到了一定的作用。同时发现缺乏淋巴结短期延迟细菌到其他组织的播散。
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