论文摘要
高效毛细管电泳（HPCE）技术,相对于大家熟知的高效液相色谱、气相色谱而言,是一种新的分离技术,它能够分离各种分子量的物质,包括蛋白质,氨基酸,核酸以及各种离子等。毛细管分离模式众多,包括毛细管区带电泳（CZE）、毛细管凝胶电泳（CGE）、胶束电动毛细管色谱（MECC）、等电聚焦电泳（IEF）、等速聚焦电泳（ITP）。毛细管区带电泳又称为自由溶液毛细管电泳,其本质特点是整个毛细管内充盈的电泳缓冲液为均质且电场强度相同,待测物根据荷质比不同而被分离,是目前应用最广的一种分离模式。本文首次采用激光诱导荧光-毛细管电泳检测大鼠海马组织内和病人脑脊液中氨基酸类神经递质,具有快速、灵敏、准确的特点,为临床和科研提供了一种有效的手段。第一部分高效毛细管电泳法分离氨基酸类神经递质方法的建立运用毛细管电泳-激光诱导荧光对谷氨酸（glutamic acid, Glu）、天冬氨酸（asparagic acid, Asp）、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid, GABA）、甘氨酸（glycine, Gly）四种氨基酸类神经递质实施了同步分离,通过调节电泳缓冲液的浓度、pH值、有机溶剂的种类和运行电压结合实际,得到四种物质完全基线分离的最适条件为电泳缓冲液100mMol/L硼酸-Tris缓冲液、pH值10.3,运行电压18 kV,有机溶剂为异丙醇。取大鼠海马组织,迅速准确称重,使用0.1mol/L高氯酸作为抗氧化剂,以10ml :1g脑组织比例低温匀浆脑组织制成脑匀浆液后离心后,取上清液-70℃冰冻保存供实验用。实验采用硼酸-Tris缓冲液为电泳缓冲液,异硫氰酸荧光素（Fluorescein Isothiocyanate,FITC）为衍生剂,毛细管电泳-激光诱导荧光检测。四种氨基酸神经递质含量（GLU、ASP、GABA、GLY）分别为10.67±0.69、2.65±0.19、2.31±0.21、2.86±0.38umol/g。在选定的实验条件下,四种氨基酸在1.0～100.0μmol/L范围内呈良好的线性关系,Glu、Asp、GABA、Gly最低检出限分别为10、23、18、15 nmol/L,4种氨基酸的批内精密度范围4.44%～9.72%,批间精密度范围6.96%～10.50%;其回收率不低于88.1%。应用毛细管电泳-激光诱导荧光法可检测大鼠脑组织氨基酸类神经递质含量,为临床研究中枢神经系统症的病理生理过程提供了一种实用简便的检验方法。第二部分毛细管电泳检测癫痫病人脑脊液中氨基酸类神经递质含量收集45例脑脊液标本,分为正常对照组、全面性大发作组与复杂部分性发作组,选用以上优化条件毛细管区带电泳进行检测,其中正常组脑脊液含量（GLU、ASP、GABA、GLY）分别为34.34±4.65、50.28±6.85、48.32±5.24、25.72±3.56umol/L,复杂部分性发作组（GLU、ASP、GABA、GLY）分别为7 8.85±9.55、91.07±11.23、73.65±9.64、50.33±8.98 umol/L,全面性大发作组（GLU、ASP、GABA、GLY）分别为54.64±7.80、69.65±8.32、52.54±6.28、38.22±5.34umol/L。GLU、ASP、GLY三种氨基酸,全面性大发作组较对照组有明显升高（P〈0.05）,但GABA含量与正常对照组无明显差别（P>0.05）;复杂部分性发作组四种氨基酸递质都较正常对照组有明显升高（P〈0.05）。且GABA含量,复杂部分性发作组较全面性大发作组和对照组都有明显升高（P〈0.05）。总结高效毛细管电泳与传统的高效液相色谱相比,本方法在分离速度、分辨率及实验成本方面均有较大改善,其与激光诱导的荧光检测器相结合,更加提高了氨基酸类神经递质的灵敏度和准确性,为临床和科研中检测脑组织和脑脊液中这类神经递质提供了一种有效的手段。