论文摘要
莨菪碱（Hyoscyamine），山莨菪碱（anisodine）和东莨菪碱（Scopolamine），属于托品烷类莨菪碱，它们广泛存在于曼陀罗（Datura）、莨菪（Hyoscyamus）等茄科植物中。由于此类生物碱有较强的抗胆碱生理活性，作用于副交感神经系统，而莨菪碱和东莨菪碱作为最普遍的解痉镇痛剂和抗胆碱药物被长期广泛应用。但在药用价值上来说,东莨菪碱的药用价值是莨菪碱的10倍。而在主要生产生物碱的茄科植物中，东莨菪碱的含量相比于莨菪碱要低。所以想要获得高效用价值的东莨菪碱以满足重要临床需求是非常重要的。在野生药用植物三分三（Anisodusacutangulus,主要产于云南民间，历史非常久远并且已被列为国家濒危物种）中，总生物碱含量相对于其他的茄科植物来说要高，含量可达到在1％以上。在茄科植物中托品烷代谢途径中，东莨菪碱的合成是由莨菪碱-6β-羟基化酶H6H（hyoscyamine 6β-hydroxylase）催化莨菪碱经过山莨菪碱而生成东莨菪碱。而莨菪碱-6β-羟基化酶H6H属于α-酮戊二酸依赖性的双加氧酶（α-oxogultaratedependent dioxygenase，2ODD）家族，它是一种双功能酶，它可以将莨菪碱的C-6位β羟基化形成山莨菪碱，然后将山莨菪碱的C-6位和C-7位环氧化形成东莨菪碱，H6H已经被证明是托品烷代谢途径中的关键酶，在植物体内起着非常重要的作用。三分三中托品烷代谢途径中的关键酶基因H6H的cDNA序列已经由本实验室成功获得，本课题在此基础上将H6H基因构建到原核表达载体pET30a和pGEX4T-1中，使表达的H6H蛋白和His和GST标签融合，从而形成两种不同重组的H6H蛋白（His-AaH6H和GST-AaH6H）。我们在大肠杆菌中进行H6H蛋白的原核表达，分析确认在重组蛋白的表达情况。在重组蛋白表达的情况下，根据重组蛋白的性质并对其进行蛋白纯化，用以证明蛋白是否以可溶的形式存在重组大肠杆菌中进行表达。根据重组蛋白的性质，我们选用蛋白的亲和层析法对蛋白进行纯化，顺利的得到了纯化的AaH6H的重组酶蛋白。通过SDS-PAGE和Western Blot分析证明该蛋白在大肠杆菌中是以活性的形式存在。此外，我们在蛋白能够以可溶的形式在大肠杆菌表达的前提下，外源添加莨菪碱到细胞培养液中，随着重组H6H蛋白的表达，莨菪碱也逐渐被转化为山莨菪碱和东莨菪碱。实验结果表明：AaH6H是一个双功能酶，既具有羟基化酶的活性（使莨菪碱转化为山莨菪），有具有环氧化的活性（山莨菪碱转化为东莨菪碱）。由此可知，通过对三分三托品烷代谢途径中关键基因H6H的研究，使我们明确了三分三中莨菪碱-6β-羟基化酶H6H体外的生化功能，有助于我们在工业生产中，有目的的生产高药用价值的东莨菪碱，从而为满足临床的需要提供了重要证据。