婴幼儿未成熟肺缺血再灌注损伤的特点、机制与保护研究

论文摘要

肺缺血再灌注导致的损伤常见于外科临床,尤以应用体外循环（CPB）技术的各类手术及肺移植术后最为突出。术后肺功能障碍对患者的预后有着不容低估的影响,成为影响CPB术后恢复的非心血管并发症的首要因素。尤其是在婴幼儿先心病手术后,此类损伤已成为直接影响术后转归的最主要因素。对其发生机制的研究和寻求有效的防治措施是近年来国内外心血管外科共同关注的重要课题。研究者们致力于采用各种手段（如白细胞滤过、缺血预适应等）及药物干预（如糖皮质激素、氧自由基清除剂、蛋白酶抑制剂以及中药等）来预防或减轻肺缺血再灌注损伤,虽取得一定的效果,但这些方法对婴幼儿未成熟肺损伤的保护作用并不显著,相关方面的研究亦少见报道。因此,有必要对此类急性肺损伤病理生理过程进行再认识;积极探索未成熟肺损伤的特点;寻求进一步的、针对性的保护方法;以此达到改善婴幼儿体外循环术后肺功能及患者预后的目的;从而提高应用体外循环技术各类手术效果,特别是对婴幼儿先心病手术治疗水平具有重大意义和临床应用价值。据文献报道,在大量前炎性细胞因子TNF-α、IL-1β及ROS等通过炎性细胞表面TOLL受体将刺激信号传递到胞浆后,髓核细胞分化因子MyD88在调控其下游的炎症信号分子表达中起着非常关键的作用;并直接影响到靶组织中炎症细胞的进一步活化和趋化及靶组织中炎症反应的程度。缺血再灌注导致ROS的过度释放,并由此引起的氧化应激、线粒体功能下降是缺血再灌注肺损伤的主要病理机制。活性最高、危害最大的是羟自由基（HO·）（ie,ROS-HR）,其主要作用靶标是含有大量不饱和脂肪酸的生物膜。MDA作为脂质过氧化的终末产物,其含量代表了生物膜不饱和脂肪酸氧化损伤的程度。同样,GSH-PX和SOD作为细胞内重要的抗氧化物质,可以反映细胞生物膜的保护能力。依达拉唪（Edaravone,MCI-186）是一种新型自由基清除剂,它可抑制由H2O2和Fe2+反应产生的细胞损伤因子·OH,可明显对抗由羟自由基及铁离子引起脂质过氧化的活性;可抑制水杨酸的羟化作用,与水杨酸竞争而显示出对·OH的清除作用,从而显示出其强大的清除自由基、抑制脂质过氧化作用。由以上分析我们提出本研究的科学假说:（1）在缺血再灌注所致未成熟急性肺损伤中炎症反应是其最主要的损伤机制,MyD88作为炎症反应信号转导通路上较上游的一个关键信号分子,通过激活下游的NF-κB进而调节靶基因表达水平,影响肺组织炎症反应的发生发展。（2）在炎症反应引起肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤过程中,ROS对线粒体的损伤是核心,而依达拉唪通过清除自由基,减轻ROS对线粒体的作用,改善肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤情况,最终保护未成熟肺的功能。针对以上科学假说,在本研究工作中,我们选用了成年（5-6月）和婴幼儿（15-21天）新西兰白兔,建立在体单肺缺血再灌注损伤模型;ELISA法检测缺血再灌注过程中各时间点的IL-1β、TNF-α水平;术毕收集肺组织分别进行MDA,ROS-HR浓度及SOD,GSH-PX活性测定;Western blot检测MyD88和NF-κB水平;并提取肺组织中的线粒体,行膜电位（ΔΨm）、肿胀率及游离钙水平测定;光镜和电镜分别观察肺组织病理和超微结构改变。比较、分析成年组与婴幼儿组缺血再灌注损伤过程中生化、免疫、病理变化特点和规律;在此基础上,进一步探讨了氧自由基清除剂依达拉唪（Edaravone）预处理对未成熟肺缺血再灌注损伤的保护作用及其可能机制。第一部分成年兔与婴幼儿兔肺缺血再灌注损伤的比较研究目的:通过成年兔与婴幼儿兔肺缺血再灌注损伤的比较研究,探讨婴幼儿兔未成熟肺损伤的特点及其可能的机制。方法:选用成年（5-6月）和婴幼儿（15-21天）新西兰白兔各24只,分别随机配到成年对照组、成年缺血再灌注组、婴幼儿对照组、婴幼儿缺血再灌注组。建立Sakuma单肺缺血再灌注模型,肺门阻断1h后,开放再灌注4h。收集各时间点的血样,ELISA法检测IL-1β、TNF-α水平;术毕收集肺组织分别进行MDA,ROS-HR浓度及SOD,GSH-PX活性测定;Western blot检测MyD88和NF-κB水平;光镜和电镜分别观察其组织病理和超微结构改变;并提取肺组织中的线粒体,行膜电位（ΔΨm）、肿胀率及游离钙水平测定。结果:缺血再灌注损伤后,肺组织损伤性变化明显。与成年兔组相比,婴幼儿兔组肺组织有更多的白细胞侵润,肺泡细胞与间隔组织肿胀明显,肺泡腔内有较多的渗液,部分肺泡腔塌陷;出血多见;电镜观察下,可见部分肺泡上皮细胞及内皮细胞脱落,线粒体肿胀明显,嵴破裂,甚至消失。线粒体膜电位下降明显,游离钙浓度明显升高;MDA,ROS-HR浓度升高,但两组存在显著差异（P＜0.01）,SOD,GSH-PX活性下降,也同样存在显著差异;缺血再灌注过程中各时点的IL-1β、TNF-α水平也有不同程度升高,特别是再灌注后的2h、4h,（P＜0.01）;再灌注后肺组织中MyD88和NF-κB表达也显著升高。结论:缺血再灌注可导致急性肺损伤;与成熟肺相比,婴幼儿未成熟肺损伤更为严重。这可能与婴幼儿相对低的抗氧化能力和产生更多的ROS有关。第二部分依达拉唪预处理对婴幼儿未成熟肺损伤保护作用研究目的:观察依达拉唪（Edaravone）预处理对缺血再灌注所致婴幼儿未成熟肺损伤组织中MDA,ROS-HR,SOD及GSH-PX表达的影响,线粒体损伤改变,探讨Edaravone清除氧自由基,减轻线粒体损伤,保护肺功能的作用。方法:选用婴幼儿（15-21天）新西兰白兔各66只,随机分配到对照组、缺血再灌注组和Edaravone预处理+缺血再灌注组。建立Sakuma单肺缺血再灌注模型,肺门阻断1h后,开放再灌注4h。Edaravone按1mg/kg于缺血前5分钟,通过耳缘静脉注射处理;术毕收集肺组织分别进行MDA,ROS-HR浓度及SOD,GSH-PX活性测定;Westernblot检测MyD88和NF-κB水平;光镜和电镜分别观察其组织病理和超微结构改变;并提取肺组织中的线粒体,行膜电位（ΔΨm）、肿胀率及游离钙水平测定。结果:依达拉唪预处理组肺组织中MDA,ROS-HR浓度明显降低,相反SOD及GSH-PX活性明显升高;同样,依达拉唪预处理后,明显抑制缺血再灌注损伤所致的线粒体膜电位（ΔΨm）的下降,线粒体的肿胀亦明显减轻;此与电镜观察下的肺超微结构改变一致,肺泡上皮与血管内皮细胞脱落明显减少,线粒体形态趋于正常,肿胀减轻,嵴破裂少;光镜观察,依达拉唪预处理组肺泡与肺泡间隔肿胀程度明显轻于缺血再灌注组,肺泡腔渗液减少,出血少见。由此导致依达拉唪预处理组的生存率（83%）明显高于缺血再灌注损伤组（50%）。结论:依达拉唪（Edaravone）可通过清除氧自由基,减轻线粒体损伤,实现对婴幼儿未成熟肺缺血再灌注损伤的保护作用。

论文目录

• 1.Abbreviations
• 2.Abstracts
• 1)Abstract in Chinese
• 2)Abstract in English
• 3.Introduction
• 1)Ischemia-reperfusion（IR）and acute lung injury（ALI）in cardiothoracic surgery
• 2)Animal models of lung IR injury（LIRI）
• 3)The mechanisms of IR-induced lung injury in general
• 4)The mechanisms of IR-induced lung injury in infants
• 5)Current preventions and treatments of lung IR injury
• 6)A new drug--Edaravone
• 4.Aims of the study
• 1)Principal objectives
• 2)Specific aims
• 5.Part Ⅰ
• 1)Purpose
• 2)Materials and methods
• 3)Results
• 4)Discussion
• ① Infant vs adult lung damage at light microscopic level
• ② Infant vs adult lung damage at electron microscopic level
• ③ Infant vs adult lung mitochondrial damage
• ④ Oxidative stress in infants vs adults
• ⑤ TNF-α,IL-1β,NF-κB and MyD88 in infants vs adults
• 6.Part Ⅱ
• 1)Purpose
• 2)Materials and methods
• 3)Results
• 4)Discussion
• ① ROS is one of the most important mediator of IR injury
• ② The choose of free radical scavenger-Edaravone
• ③ Dosing and timing of Edaravone
• ④ Therapeutic effects of Edaravone
• 7.Conclusions
• 8.Future studies and perspectives
• 1.Molecular mechanism underlying IR-induced lung injury
• 2.Prevention and treatment of IR-induced lung injury
• 9.References
• 10.Acknowledgements
• 11.List of publications
• 12.Appendix
• 1)Papers
• 2)Meetings