重组人Bikunin的制备及其抑制肿瘤浸润和转移的研究

论文摘要

本研究成功构建了重组人Bikunin（rhBikunin）表达载体pPICZαC-bik,利用巴斯德毕赤酵母稳定分泌表达了具有正确N-端序列的rhBikunin。rhBikunin具有与天然Bikunin相同的胰蛋白酶、纤溶酶等丝氨酸蛋白水解酶抑制活性,比活性为5600 IU/mg,并具有与天然Bikunin相同的热稳定性和酸碱稳定性。糖基化分析实验证实,rhBikunin不含硫酸软骨素糖链。利用80 L发酵罐进行了rhBikunin中试规模发酵条件的优化,产量达55 mg/L,并建立了一种适于大规模纯化rhBikunin的新方法,收率为66%,纯度达95%。体内、外分析实验表明,rhBikunin能有效抑制人高转移卵巢癌HO8910 PM细胞的体外浸润和转移,以及小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤在体内的自发肺转移,且具有与天然Bikunin相同的作用效果。rhBikunin抑制肿瘤浸润和转移的作用,与其抑制uPA系统从而抑制肿瘤细胞外基质的降解有关。本实验的创新之处在于:1)利用巴斯德毕赤酵母真核表达系统建立了制备高纯度rhBikunin的新方法;2)证实rhBikunin具有与天然Bikunin相同的生物学作用。

论文目录

• 内容提要
• 第一章 绪论
• 1 Bikunin 的基因与蛋白质结构
• 1.1 bikunin 基因结构特点
• 1.2 Bikunin 质结构特点
• 2 Bikunin 的生物学作用
• 2.1 Bikunin 在炎症中的作用
• 2.2 Bikunin 在肿瘤细胞浸润和转移中的作用
• 2.3 Bikunin 对缺血-再灌注损伤的保护性作用
• 3 Bikunin 的临床应用
• 3.1 在治疗炎症中的应用
• 3.2 在治疗休克中的应用
• 3.3 在手术和体外循环中的应用
• 4 基因工程表达系统
• 4.1 大肠杆菌表达系统
• 4.2 昆虫细胞表达系统
• 4.3 哺乳动物细胞表达系统
• 4.4 植物生物反应器
• 4.5 酵母表达系统
• 5 巴斯德毕赤酵母表达系统的研究进展
• 5.1 巴斯德毕赤酵母表达系统的广泛应用
• 5.2 巴斯德毕赤酵母表达系统对外源蛋白表达的影响
• 第二章 重组人Bikunin 在毕赤酵母中的表达及大规模制备
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 rhBikunin 表达载体的构建
• 1.3 毕赤酵母的转化
• 1.4 阳性菌株的筛选
• 1.5 rhBikunin 发酵培养基pH 值优化
• 1.6 表达产物的分析
• 1.7 利用80 L 发酵罐大规模发酵表达rhBikunin
• 1.8 rhBikunin 的纯化
• 1.9 rhBikunin 的糖基化分析
• 1.10 rhBikunin 的理化性质分析
• 1.11 rhBikunin 对纤溶酶的抑制作用分析
• 2 结果
• 2.1 rhBikunin 表达载体的构建
• 2.2 阳性转化子的筛选
• 2.3 发酵条件的优化
• 2.4 rhBikunin 的分析鉴定
• 2.5 rhBikunin 的大规模发酵与纯化
• 2.6 rhBikunin 的糖基化分析
• 2.7 rhBikunin 的理化性质分析
• 2.8 rhBikunin 对纤溶酶的抑制作用
• 3 讨论
• 3.1 rhBikunin 表达载体的构建
• 3.2 rhBikunin 在毕赤酵母中的表达
• 3.3 影响rhBikunin 在P. pastoris 中表达水平的因素
• 第三章 rhBikunin 抑制肿瘤浸润和转移的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 主要仪器和器材
• 1.2 细胞株和实验动物
• 1.3 主要试剂及配制
• 1.4 细胞培养
• 1.5 肿瘤细胞体外增殖能力测定
• 1.6 肿瘤细胞体外粘附能力测定
• 1.7 肿瘤细胞体外迁移和浸润能力测定
• 1.8 小鼠Lewis 肺癌在C578L/6 小鼠体内的转移试验
• 1.9 rhBikunin 对肿瘤细胞或组织uPA 表达的影响
• 1.10 统计学方法
• 2 结果
• 2.1 rhBikunin 对H08910 PM 细胞体外增殖能力的影响
• 2.2 rhBikunin 对H08910 PM 细胞体外粘附能力的影响
• 2.3 rhBikunin 对H08910 PM 细胞体外迁移能力的影响
• 2.4 rhBikunin 对H08910 PM 细胞体外浸润能力的影响
• 2.5 rhBikunin 对荷瘤小鼠体内肿瘤浸润转移的抑制作用
• 2.6 rhBikunin 对肿瘤细胞或组织uPA 表达的影响
• 3 讨论
• 3.1 rhBikunin 对H08910 PM 细胞体外浸润和转移的抑制作用
• 3.2 rhBikunin 对C578L/6 荷瘤小鼠体内肿瘤浸润和转移的抑制作用
• 3.3 rhBikunin 对肿瘤细胞uPA 表达的影响
• 研究总结
• 参考文献
• 攻博期间发表的学术论文及其他成果
• 附录一 重组表达载体pPICZαC-bik 序列分析结果
• 附录二 rhBikunin Mono S 阳离子交换层析分离图谱
• 附录三 H08910 PM 细胞在Matrigel 中的浸润和迁移
• 附录四 Lewis 肺癌皮下移植瘤小鼠模型
• 附录五 小鼠Lewis 肺癌原发瘤组织
• 中文摘要
• Abstract
• 致谢