同型半胱氨酸对人内皮细胞的损伤机制及丹皮酚保护作用的实验研究

论文摘要

近年来大量临床和实验研究证明,同型半胱氨酸（homocysteine, Hcy）已成为致动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）的一种独立的危险因素n],在心脑血管疾病及外周血管硬化等疾病发病机制中起重要作用。但Hcy致AS的具体机制尚不清楚,因此探讨同型半胱氨酸诱导AS的发病机制具有十分重要的意义。丹皮酚作为传统的中药有效成分,具有广泛的药理活性,其中在心血管方面有抗AS,抗血栓,抗心律失常等作用。目前,已有资料表明丹皮酚在整体水平保护血管内皮细胞,减轻AS的进程,但丹皮酚在细胞水平保护Hcy所致AS的研究尚未见报道。本研究以Hcy为损伤因子建立内皮细胞损伤模型,观察Pae对人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Veins Endothelial Cells, HUVECs）的保护作用,并探讨其分子机制,为临床应用Pae防治动脉粥样硬化提供有价值的实验和理论依据。第一部分同型半胱氨酸对人脐静脉内皮细胞的损伤机制研究目的：观察同型半胱氨酸（Hcy）对人脐静脉内皮细胞（HUVECs） NF-κB通路、eNOS及NO含量的影响,探讨Hcy对内皮细胞损伤的可能的分子机制,为防治动脉粥样硬化提供新的治疗靶点。方法：1. HUVECs的分离培养：用0.1%I型胶原酶与0.25%胰蛋白酶-0.0.2%EDTA等比混合消化液消化法收集HUVECs,加入含20%胎牛血清、20μg/L bFGF的DMEM培养基在37℃、5%CO2培养箱中培养,用0.125%胰蛋白酶-0.01%EDTA进行消化传代培养。2.实验分组：实验用第2、3代细胞,实验分为正常对照组（HO）, Hcy剂量组。正常对照组细胞加含20%胎牛血清、20μg/L bFGF的DMEM培养基；Hcy剂量组细胞在上述培养基基础上再分为4组,分别加入2.5mmol/LHcy（H1）、5mmol/L Hcy （H2）、10mmol/L Hcy （H3）及15mmol/L Hcy （H4）。各分组细胞继续培养24h。3.倒置显微镜观察各组HUVECs细胞形态变化。4.MTT法检测各组HUVECs细胞活力。5. RT-PCR检测各组HUVECs NF-κB p65、eNOS mRNA的表达。6. Western blotting检测各组HUVECs IκB-α、ICAM-1蛋白的表达。7.免疫组化法检测各组HUVECs中NF-κB p65核转移的变化。8.硝酸还原酶法检测各组HUVECs培养液中NO的含量。结果：1. HUVECs的分离培养原代培养的HUVECs呈典型的单层铺路石样或鹅卵石样镶嵌排列。传代细胞的形态及生长方式与原代培养细胞类似,汇合后细胞也呈单层铺路石状或鹅卵石样镶嵌排列。2.倒置显微镜观察细胞形态变化如下：与正常对照组相比,H1组细胞形态无明显变化,H2组细胞形态发生变化,细胞收缩,间隙增宽,变圆。H3、H4组损伤作用明显,细胞呈团簇状,轮廓不清.有较多细胞脱落。3.MTT法检测各组HUVECs细胞活力与正常对照组比较,H1组细胞活力无明显变化（P>0.05）,无统计学意义；H2、H3、H4组细胞活力明显下降（P<0.01）。4. RT-PCR检测各组HUVECs NF-κB p65. eNOS mRNA的表达4.1NF-κB p65mRNA的表达：与正常对照组比较,Hcy各剂量组NF-κB p65mRNA的表达明显增强（P<0.05,P<0.01）,且呈现一定的剂量依赖性（P<0.05）。4.2eNOS mRNA的表达：与正常对照组比较,H1组eNOS mRNA表达无明显变化,无统计学意义（P>0.05）。H2、H3、H4组eNOS mRNA的表达明显减少（P<0.01）,且呈现一定的剂量依赖性（P<0.05）。5. Western blotting检测各组HUVECs IκB-α、ICAM-1蛋白的表达5.1IκB-α蛋白的表达：与正常对照组比较,Hcy各剂量组IκB-α蛋白的表达均明显降低（P<0.05,P<0.01）,且具有一定的剂量依赖性（P<0.05）。5.2ICAM-1蛋白的表达：与正常对照组比较,Hcy各剂量组ICAM-1蛋白的表达均明显增多（P<0.05,P<0.01）。6.免疫组化法检测各组HUVECs细胞NF-κB p65核转移变化NF-κB p65阳性表达产物为棕黄色颗粒。正常对照组中,NF-κB p65在细胞中基本无表达。H1组棕黄色颗粒较少,H2、H3、H4组棕黄色颗粒明显增加,并且随着Hcy浓度的增加,细胞核内棕黄色颗粒明显增多,表明具有明显的核转移倾向。与正常对照组比较,Hcy各剂量组NF-κB p65的表达明显增强（P<0.01）。7.硝酸还原酶法检测各组HUVECs培养液中NO的含量与正常对照组比较,Hcy各剂量组HUVECs生成的NO逐渐减少（P<0.05,P<0.01）,且呈现一定的剂量依赖性的关系（P<0.05）。结论：1.Hcy通过增强NF-κB p65mRNA的表达,加速IKB-α蛋白的降解,促进NF-κB p65的释放、活化,转移进细胞核,上调ICAM-1的表达。2.Hcy通过抑制eNOS mRNA的表达,使eNOS合成减少,活性降低,进而减少HUVECs内NO的生成。第二部分丹皮酚对同型半胱氨酸损伤的人脐静脉内皮细胞保护作用的研究目的：采用人脐静脉内皮细胞（HUVECs）为研究对象,以同型半胱氨酸为损伤因子建立内皮细胞损伤模型,观察Pae对同型半胱氨酸损伤的内皮细胞NF-κB通路、eNOS及NO含量的影响,探讨Pae对内皮细胞的保护作用及其抗动脉粥样硬化的分子机制。方法：1.实验分组实验分为5组,正常对照组,Hcy损伤模型组（Hcy10mmol/L组）,Pae低剂量组（10mmol/L Hcy+0.15mmol/L Pae）,Pae中剂量组（10mmol/LHcy+0.3mmol/L Pae）,Pae高剂量组（10mmol/LHcy+0.6mmol/L Pae）.2.倒置显微镜观察各组HUVECs细胞形态学变化。3.MTT法检测各组HUVECs细胞活力。4. RT-PCR法检测各组HUVECs NF-κB p65、eNOS mRNA的表达。5. Western blotting检测各组HUVECs IκB-α、ICAM-1蛋白的表达。6.免疫组化法检测各组HUVECs中NF-κB p65核转移的变化。7.硝酸还原酶法检测各组HUVECs培养液中NO的含量。结果：1.倒置显微镜观察细胞形态变化如下：与正常对照组比较,Hcy损伤模型组的细胞出现片状分离,脱落现象。Pae保护组使细胞间隙变窄,形态趋于正常。2.MTT法检测各组HUVECs细胞活力与正常对照组比较,Hcy损伤模型组细胞活力明显降低（P<0.01）。与Hcy损伤模型组比较,Pae各剂量组的细胞活力明显升高（P<0.01）,且具有一定的剂量依赖性（P<0.05）。3. RT-PCR检测各组HUVECs NF-κB p65. eNOS mRNA的表达3.1NF-κB p65mRNA的表达：与正常对照组比较,Hcy损伤模型组NF-κB p65mRNA的表达明显增强（P<0.01）。与Hcy损伤模型组比较,Pae各剂量组（低、中、高）的NF-κB p65mRNA表达明显降低（P<0.05,P<0.01）,并呈现一定的剂量依赖性（P<0.05）。3.2eNOS mRNA的表达：与正常对照组比较,Hcy损伤模型组eNOS mRNA的表达明显降低（P<0.01）。与Hcy损伤模型组比较,Pae各剂量组（低、中、高）的eNOS mRNA的表达明显增强（P<0.01）,并呈现一定的剂量依赖性（P<0.05）。4. Western blotting检测各组HUVECs IκB-α、ICAM-1蛋白的表达4.1IκB-α蛋白的表达：与正常对照组比较,Hcy损伤模型组IκB-α蛋白表达明显降低（P<0.01）。与Hcy损伤模型组比较,Pae各剂量组（低、中、高）IκB-α蛋白表达明显增加（P<0.01）。4.2ICAM-1蛋白的表达：与正常对照组比较,Hcy损伤模型组ICAM-1蛋白表达明显增加（P<0.01）。与Hcy损伤模型组比较,Pae各剂量组（低、中、高）ICAM-1的表达逐渐降低,差异具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。5.免疫组化法检测各组HUVECs中NF-κB p65核转移的变化Hcy损伤模型组中胞质和胞核中均有棕黄色颗粒。与正常对照组比较,差异有显著性（P<0.01）。Pae低剂量组中胞核内仍有大量棕黄色颗粒,Pae中剂量组中胞核内的棕黄色颗粒明显减少,Pae高剂量组中,胞核中几乎无棕黄色颗粒。与Hcy损伤模型组比较,Pae各剂量组在细胞核内NF-κB p65的阳性表达产物明显减少（P<0.01）。6.硝酸还原酶法检测各组HUVECs培养液中NO的含量与正常对照组比较,Hcy损伤模型组HUVECs生成的NO明显减少（P<0.01）。与损伤模型组比较,Pae各剂量组NO的含量明显升高（P<0.05,P<0.01）,并呈现一定的剂量依赖性（P<0.05）。结论：1.Pae对同型半胱氨酸损伤的内皮细胞具有保护作用。2.Pae通过降低同型半胱氨酸损伤的内皮细胞中NF-κB p65mRNA表达,抑制NF-κB的活化,下调ICAM-1蛋白的表达。3.Pae通过促进eNOS mRNA的表达,进而提高同型半胱氨酸损伤的内皮细胞内NO的含量。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩写
• 第一部分 同型半胱氨酸对人脐静脉内皮细胞的损伤机制研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 丹皮酚对同型半胱氨酸损伤的人脐静脉内皮细胞保护作用的研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 结论
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历