小鼠狼疮样综合征模型的建立以及雷公藤红素抗炎免疫抑制作用的研究

论文摘要

目的：采用伴刀豆球蛋白（Concanavalin A，ConA）活化淋巴细胞提取的染色质免疫同系小鼠，摸索建立稳定的系统性红斑狼疮（SLE）样自身免疫反应亢进小鼠模型方法，并进一步观察模型的各项指标的变化，使模型标准化。通过观察雷公藤红素和泼尼松对SLE样自身免疫反应亢进小鼠模型的作用，对该模型进行进一步验证。观察雷公藤红素对佐剂性关节炎的治疗作用。通过观察红素对两种不同的自身免疫性疾病模型的治疗作用，进一步了解雷公藤红素抗炎免疫作用机制。方法：ConA活化的BALB／c小鼠脾细胞中提取活性染色质。以染色质100μg／只d0、d14、d28背部皮内注射免疫同系小鼠三次，建立SLE样自身免疫反应亢进小鼠模型。通过酶联免疫吸附法（ELISA）测定血清中抗双链DNA（dsDNA）、抗单链DNA（ssDNA）、抗组蛋白抗体和总IgG的动态变化，用Hep-2细胞作抗核抗体核型的检测。观察脾淋巴细胞转化，用ELISA法测定血清中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的水平、脾淋巴细胞培养上清中干扰素-γ（IFN-γ）的水平，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导腹腔巨噬细胞产生TNF-α的水平。用硝酸还原酶比色法检测亚硝酸盐含量以反映血清一氧化氮（NO）水平。用50％溶血试验法测定血清中总补体含量。进行了红细胞、白细胞、血小板的计数。通过尿蛋白检测，免疫组化及光镜观察肾脏病理损伤。ConA活化同系小鼠脾淋巴细胞提取的染色质，d0免疫BALB／c小鼠诱发红斑狼疮（SLE）样综合征，醋酸泼尼松(Prednisone 5 mg·kg-1·d-1)、雷公藤红素(Tripterine 6、12 mg·kg（-1）·d-1)灌胃给药（d35-d50），观察雷公藤红素对活化染色质诱导的红斑狼疮样综合征小鼠的治疗作用。检测内容包括MTT法检测脾淋巴细胞转化；ELISA法检测小鼠血清中总IgG、抗dsDNA抗体、抗ssDNA抗体、抗组蛋白抗体水平；硝酸还原酶法检测血清NO的水平；用ELISA法测定脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ的水平，LPS诱导腹腔巨噬细胞产生白细胞介素-10（IL-10）的水平。考马斯亮蓝法检测小鼠尿蛋白；光镜下观察药物对肾脏病理改变的影响。大鼠右后足足跖皮内注射0.1ml完全福氏佐剂诱发佐剂性关节炎。醋酸泼尼松(Prednisone 10 mg·kg-1·d-1)，雷公藤红素(Tripterine 5、10、20 mg·kg-1·d-1)灌胃给药。致炎d19开始给药，连续6天（d19—d24）；用大鼠后足测量仪测大鼠后足体积，观察雷公藤红素对原发性和继发性足肿以及对全身病变的影响；光镜下观察药物对关节病理改变的影响。取关节炎大鼠腹腔巨噬细胞，采用离体实验观察雷公藤红素的作用机制：化学法测定对巨噬细胞NO释放水平的影响、反转录测定对巨噬细胞白细胞介素-1β（IL-1β）和TNF-αmRNA表达水平的影响，ELISA法测定对巨噬细胞核转录因子NF-κB水平的影响。结果：（一）SLE样小鼠模型的诱导和特征在免疫后d45和d60活性染色质免疫小鼠的IgG类抗dsDNA、抗ssDNA、抗组蛋白抗体和总IgG均明显升高（P＜0.05）。血清抗核抗体核型主要为均质型和胞浆型。而正常小鼠和正常染色质免疫小鼠，未见抗核抗体水平的明显升高。与正常小鼠和正常染色质免疫小鼠相比，在免疫后d45和d60，活性染色质免疫小鼠的脾淋巴细胞在未加致裂原时，细胞增殖明显，而用ConA及LPS刺激后细胞增殖水平下降，有免疫失常的表现。活性染色质免疫小鼠血清NO水平在免疫后d45（P＜0.05）和d60（P＜0.01）升高。与正常小鼠比较，正常染色质组和活性染色质组小鼠脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ水平和腹腔巨噬细胞培养上清以及血清中TNF-α水平均有一定的降低，但活性染色质组的下降更为明显。活性染色质组小鼠与其他两组相比，尿中蛋白质水平升高，肾脏有中～重度的免疫球蛋白沉积，绝大多数局限于肾小球；肾病理切片镜检，可见活性染色质组小鼠有阶段性或弥散性的肾小球损伤，肾小球系膜细胞的增生，基底膜增厚，轻度的单核细胞侵润，而与其他两组肾病理切片正常。此外，活性染色质组小鼠在d60还检测到一定的补体水平下降，血象中血小板明显减少（P＜0.05）。（二）雷公藤红素对SLE样小鼠模型的治疗作用雷公藤红素对SLE样小鼠模型的抗自身抗体争总IgG水平的影响溶剂对照模型组与正常对照和正常染色质组相比，抗自身抗体和总IgG明显升高（P＜0.001，P＜0.05）。与溶剂对照模型组相比，雷公藤红素(6、12mg·kg-1·d-1)和醋酸泼尼松(5 mg·kg-1·d-1)明显抑制三种抗自身抗体和总IgG的升高（P＜0.001、P＜0.01，）。与醋酸泼尼松相比，雷公藤红素12 mg·kg-1·d-1降低抗-ssDNA（p=0.027）、抗组蛋白（p=0.033）抗体作用更强雷公藤红素对SLE样小鼠模型脾淋巴细胞增殖的影响在没有致裂原刺激的情况下，溶剂模型对照组的脾淋巴细胞增殖水平明显高于正常对照和正常染色质对照组（p＜0.001），但致裂原刺激后溶剂模型对照组的脾淋巴细胞增殖水平与两个对照组相比明显处于低水平（p＜0.001）。与溶剂模型对照组比较，雷公藤红素12 mg·kg-1·d-1可明显改善模型动物受ConA和LPS刺激后低水平的增殖（p＜0.05），但对未加致裂原刺激的脾细胞增殖影响不明显。雷公藤红素6 mg·kg-1·d-1对脾淋巴细胞转化的影响不明显。雷公藤红素对SLE样小鼠模型白细胞介素-10（IL-10）和干扰素-γ（IFN-γ）产生的影响与正常组和正常染色质组比较，溶剂模型对照组的腹腔巨噬细胞产生IL-10水平升高，而脾细胞培养上清中IFN-γ水平降低（p＜0.001，p＜0.05）。与溶剂模型对照组比较，雷公藤红素6、12 mg·kg-1·d-1抑制IL-10的产生（p＜0.001），但对脾细胞培养上清中IFN-γ的水平无作用。雷公藤红素对SLE样小鼠模型尿蛋白和血清NO水平的影响与正常组和正常染色质组比较，溶剂模型对照组有较高水平的蛋白尿（p＜0.001）。与溶剂模型对照组相比，雷公藤红素12 mg·kg-1·d-1可降低蛋白尿水平（p＜0.05）。雷公藤红素6 mg·kg-1·d-1醋酸泼尼松(5 mg·kg-1·d-1)可在一定程度上降低蛋白尿水平，但没有统计上的显著性。与正常组和正常染色质组比较，溶剂模型对照组血清NO水平明显升高（p＜0.001），雷公藤红素12 mg·kg-1·d-1降低升高的血清NO水平（p＜0.001）。雷公藤红素6 mg·kg-1·d-1对血清NO水平无明显的影响。雷公藤红素对SLE样小鼠模型肾损害的影响溶剂模型对照组显示有节段性或弥散性的肾损害（n=6），肾损害的特点是明显的肾小球系膜细胞增生，肾小球毛细血管轻度单核细胞侵润。此类改变在正常组和正常染色质组未见。雷公藤红素12 mg·kg-1·d-1明显改善肾损害（p＜0.01），雷公藤红素6 mg·kg-1·d-1虽有一定的改善作用，但无统计学意义。（三）雷公藤红素对大鼠佐剂性关节炎的治疗作用及作用机制的研究雷公藤红素对大鼠佐剂性关节炎的治疗作用佐剂性关节炎发病后开始给药，连续6天（d19—d24），雷公藤红素5、10、20 mg·kg-1·d-1可明显抑制进展中的原发性和继发性关节炎、抑制全身炎症反应。雷公藤红素大剂量(20 mg·kg-1·d-1)，治疗效果更为明显，并在停药4天内未见明显反跳。X-线片和病理切片显示雷公藤红素20 mg·kg-1·d-1明显改善关节损伤和组织肿胀（P＜0.05）。雷公藤红素对佐剂性关节炎大鼠腹腔巨噬细胞的作用（离体研究）离体研究表明，雷公藤红素（0.1μg／ml～1μg／ml）能降低佐剂性关节炎大鼠腹腔巨噬细胞LPS刺激后的一氧化氮（P＜0.01）释放水平，降低其白介素-1β（IL-1β）（P＜0.01）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）（P＜0.05）的mRNA表达水平，降低巨噬细胞核转录因子NF-κB水平（0.01μg／ml～1μg／ml，P＜0.01）。Hoechst荧光染色结果显示，雷公藤红素＞0.1μg／ml诱导巨噬细胞凋亡。结论：活性染色质可同系诱发BALB／c小鼠的狼疮样综合征，其症状与临床SLE类似。雷公藤红素和醋酸泼尼松对红斑狼疮样综合征有治疗作用。活性染色质诱导建立的SLE样综合征小鼠模型可用于相关药物作用机制的研究。研究结果显示雷公藤红素对佐剂性关节炎有治疗作用。雷公藤红素从分子水平上抑制佐剂性关节炎大鼠腹腔巨噬细胞的活性，并有可能通过以上途径发挥其对佐剂性关节炎的治疗作用。雷公藤红素对两种不同的自身免疫性疾病模型均具有抗炎免疫抑制作用。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一部分 小鼠狼疮样综合征模型的建立
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 雷公藤红素对小鼠狼疮样综合征的有效治疗作用
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料和方法
• 实验结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第三部分 雷公藤红素对大鼠佐剂性关节炎的有效治疗作用
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料和方法
• 实验结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第四部分 综述
• 综述（一） 小鼠系统性红斑狼疮模型研究概况
• 综述（二） 雷公藤红素药理作用研究
• 本文创新点及进展
• 博士研究期间发表论文和工作情况
• 致谢