“绿色”胰岛β细胞转基因斑马鱼及应用

论文摘要

目的:本课题旨在使用转基因和绿色荧光蛋白示踪技术,建立活体“绿色”胰岛β细胞转基因斑马鱼模型;在此基础上初步探索结合化学遗传学方法靶向清除破坏胰岛β细胞。胰岛β细胞破坏模型的建立为活体高通量筛选胰岛β细胞再生的小分子化合物和中草药奠定了研究基础。方法:利用分子克隆和显微注射方法建立绿色荧光蛋白标记的胰岛β细胞转基因斑马鱼系;PCR技术、全胚胎原位杂交和活体成像技术,从DNA,RNA和蛋白质三个水平证实GFP的表达可以特异性反映内源性胰岛素的表达情况;遗传学方法进一步建立胰岛β细胞破坏的活体转基因斑马鱼动物模型。结果: 1、用酶切鉴定正确的重组质粒p-IsceI-INS:nfsB-GFP进行显微注射,建立胰岛β细胞转基因斑马鱼系。2、荧光筛选获得生殖系稳定遗传的F1代胰岛β细胞转基因斑马鱼。PCR、全胚胎原位杂交和活体成像分别从DNA,RNA和蛋白质三个不同的水平证实外源性基因INS:nfsB-GFP整合进入斑马鱼基因组。3、连续动态监测活体斑马鱼胰岛β细胞发育情况。从受精后24h脊索中线位置上单个细胞层的厚度到受精后48小时胰岛β细胞由中线向右迁移,形成不对称的分布。受精后的120小时,胰岛β细胞最终形成了一个右位器官。4、10mM甲硝唑与转基因斑马鱼胚胎共同孵育48小时,nfsB蛋白将无毒性的前体药物转变为细胞毒素,在活体直接破坏胰岛β细胞。结论: 1、通过转基因技术,建立活体可视化“绿色”胰岛β细胞发育的转基因斑马鱼系。2、运用全胚胎原位杂交和基因组PCR技术证实GFP对胰岛β细胞可靠的示踪性和稳定的基因组整合。3、通过化学遗传学方法,初步建立了胰岛β细胞破坏的活体斑马鱼动物模型。4、本研究成功构建的可示踪胰岛β细胞破坏的活体转基因斑马鱼系,为进一步研究胰岛β细胞再生,以及整体动物水平上筛选具有胰岛β细胞再生的小分子化合物和中草药提供了一个重要的新型模式生物。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料与方法
• 1. 主要试剂和材料
• 2. 主要仪器设备
• 3. 研究方法
• 实验结果
• 1. 转基因表达载体的克隆
• 2. 转基因系的筛选
• 3. 转基因系的证实
• 4. 转基因系的表达情况和胰岛β细胞破坏动物模型的建立
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录：文献综述
• 主要符号和缩略词表
• 致谢
• 个人简历