Ⅱ型单纯疱疹病毒糖蛋白D的表达、纯化、结晶以及结构解析

论文摘要

疱疹病毒是一种常见病原微生物，在自然界中能感染众多宿主。单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus type， HSV）是疱疹病毒科α亚科，其复制周期短，繁殖速度快。根据血清型分类，HSV分为两个种类，分别是I型单纯疱疹病毒（HSV-1）和Ⅱ型单纯疱疹病毒（HSV-2）。HSV-1易感染人的口腔以及眼上皮细胞，导致口腔疱疹、单纯疱疹病毒性角膜炎等疾病。HSV-2则主要感染人的生殖系统，引起生殖器疱疹。该性病的发病率仅次于淋病和梅毒。HSV-1和HSV-2均能潜伏感染神经细胞。不论是HSV-1还是HSV-2，单纯疱疹病毒感染细胞都离不开三个过程：粘附、受体结合、融合。在这三个过程中，HSV囊膜上的糖蛋白起到了重要作用。gC和gB与受体结合后使得病毒的囊膜和细胞的脂质膜靠近，从而病毒粘附在细胞上。gD与nectin-1/nectin-2、HVEM、3-O-硫酸乙酰肝素、gB与PILRα、Non-muscle myosin ⅡA进行受体识别和结合。之后形成的gD、gB、gH和gL的四元复合物引发膜融合。其中gD在病毒与宿主细胞的膜融合过程中作用关键。根据已经解析的HSV-1gD以及其与受体HVEM的复合体的结构发现，gD的C端回折缠绕在N端的受体结合位点，但当受体结合时，C端让出该结合位点。而C端与gB、gH和gL形成融合符合物。由于HSV-1和HSV-2二者感染的细胞不同，并且不同株系病毒的囊膜蛋白gD选择的受体也有所不同。为了了解HSV-1gD和HSV-2gD在受体选择上的差异，需要进一步研究这两种蛋白与其受体结合的细节。而目前所得到的gD蛋白结构仅是HSV-1KOS株的gD（1-259）、（1-306）以及与HVEM的复合物结构，并没有HSV-2gD的结构。故在本文中利用杆状病毒表达系统表达出HSV-2stain333的gD蛋白的胞外部分区域（1-285aa），经过Ni-NTA亲和层析以及分子排阻层析纯化后，浓缩至5mg/ml和10mg/ml，进行悬滴气相扩散法筛选蛋白晶体的生长条件，并得到初筛的晶体。在初筛的晶体生长条件下进行优化。优化后的晶体生长条件为0.1M Hepes pH7.2,5%（v/v） MPD，10%PEG10000，18o C。经过X-射线衍射后，得到了分辨率为1.8的一套晶体衍射数据。分析后的数据显示晶体属于P21空间群，晶胞参数为a=63.6, b=55.4, c=65.3, β=96.3°。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 1.文献综述
• 1.1 单纯疱疹病毒的概述
• 1.2 单纯疱疹病毒的入侵机制的概述
• 1.3 几种与入侵机制相关的囊膜糖蛋白研究进展的概述
• 1.3.1 糖蛋白 C（gC）
• 1.3.2 糖蛋白 D（gD）
• 1.3.3 糖蛋白 B（gB）
• 1.3.4 糖蛋白 H（gH）
• 1.3.5 糖蛋白 L（gL）
• 1.4 糖蛋白 D 及其受体的研究进展
• 1.4.1 nectin-1/necitn-2---IgSF
• 1.4.2 HVEM---The TNF receptor family
• 1.4.3 改造后的硫酸乙酰肝素
• 1.4.4 受体的选择和使用
• 1.4.5 HSV 入侵细胞的方式
• 1.4.6 gD 与受体互作在启动融合中的作用
• 1.5 杆状病毒表达系统
• 2.前言
• 3.材料与方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 常用试剂
• 3.1.2 常用分析软件
• 3.1.3 常用菌株
• 3.1.4 常用质粒
• 3.1.5 常用仪器
• 3.1.6 所用引物
• 3.2 方法
• 3.2.1 技术路线
• 3.2.2 实验方法
• 4.结果与分析
• 4.1 构建 HSV-2 gD（1-285）— pFastBac 克隆
• 4.2 构建重组杆状病毒质粒（Bacmid）
• 4.3 构建重组杆状病毒
• 4.4 HSV-2 gD（1-285aa）试表达
• 4.5 Ni-NTA 亲和层析纯化（Ni-NTA affinity chromatography）
• 4.6 分子筛层析纯化（size chromatography）
• 4.7 蛋白的纯度鉴定以及 N 端测序
• 4.8 晶体筛选
• 4.9 V2gD（1-285）晶体的衍射数据收集及其处理
• 4.10 V2gD（1-285）晶体结构分析
• 4.10.1 V2gD（1-285）晶体结构的整体概述
• 4.10.2 V2gD（1-285）的糖基化位点
• 5.讨论与展望
• 5.1 V2gD（1-285）结构的意义
• 5.2 HSV2 gD 的结构与 HSV1 gD 的结构的比较
• 5.3 HSV-2 gD 结构学上的进一步研究
• 参考文献
• 附录
• 缩略词表
• 载体图谱
• 致谢
• 作者简介