实验性静脉血栓栓塞症血管内膜及其生长因子的研究

论文摘要

[背景]静脉血栓栓塞症（venous thromboembolism，VTE）包括肺血栓栓塞症（pulmonary thromboembolism，PTE）和深静脉血栓形成（deep vein thrombosis，DVT），PTE是DVT的重要并发症，DVT是PTE的主要栓子来源，二者有共同的危险因素和治疗，故应将DVT和PTE作为一个疾病来研究。VTE是一个与多因素有关的血栓栓塞性疾病，基本病理生理仍遵循Virchow三要素（血流淤滞、血管壁损伤和血液高凝状态），现代研究证明血管内皮细胞微损伤和功能不全是血栓形成的核心，VTE复发、栓子的转归，甚至慢性血栓栓塞性肺动脉高压均可能与内皮细胞微损伤和功能不全有关。本研究通过实验性VTE模型，研究VTE的血管内膜结构、功能变化及其生长因子的作用，以进一步深入理解VTE的自然史和病理生理机制。[目的]1．建立大鼠VTE（DVT和DVT-PTE）模型，监测PTE循环和呼吸病理生理改变。2．观察大鼠VTE股静脉和肺动脉血管内膜的变化。3．测定大鼠VTE血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）的变化，探讨其对VTE病理的影响。[方法]1．分组：Sprague-Dawley大鼠120只，随机分为DVT组（18只）和DVT-PTE组（54只）、假手术（Sham）组（48只）。DVT组依据血栓形成持续时间1天、4天、7天不同分为DVT1、DVT4、DVT7三个亚组（简称D1、D4、D7组），每亚组6只；DVT-PTE组依据DVT时间（1天、4天、7天）不同和肺血栓栓塞症的持续时间（1天、4天、7天）不同分为DVT1-PTE1、DVT1-PTE4、DVT1-PTE7、DVT4-PTE1、DVT4-PTE4、DVT4-PTE7、DVT7-PTE1、DVT7-PTE4、DVT7-PTE7九个亚组（简称D1P1、D1P4、D1P7、D4P1、D4P4、D4P7、D7P1、D7P4、D7P7），每亚组6只。Sham组依据上述相应时间分为十二个亚组，每亚组4只。2．造模：采用显微血管夹阻滞一侧股静脉血流，形成层状血栓，制备DVT模型；依据DVT不同时间，分离有血栓的股静脉段，摘取血栓，通过套管针从另一侧股静脉将血栓注入，制备DVT-PTE模型。3．监测各组平均肺动脉压力（mPAP）和平均右心室压力（mRVP），行动脉和混合静脉血气分析。4．各组肺组织和股静脉切片HE染色观察肺脏和血管病理变化，应用Cmias2001B型多功能真彩色病理图像分析系统测量DVT-PTE各组栓塞和非栓塞肺动脉的管壁面积与血管面积比值和管壁厚与血管外径比值。5．电镜下观察DVT组股静脉和DVT-PTE组肺动脉血管内膜变化。6．采用免疫组织化学方法检测各组VEGF、bFGF在肺组织的表达部位及水平；通过Western blot、RT-PCR方法半定量测定肺组织中上述二种因子的蛋白和mRNA表达水平；利用ELISA方法测定血清中VEGF、bFGF浓度。7．应用方差分析和非参数检验比较组间差异，并行相关和交互作用分析，p＜0.05为差异有显著性。[结果]1．建立VTE大鼠模型：下肢股静脉显微血管夹阻滞血流制备DVT模型成功率100％。54只大鼠DVT-PTE造模过程顺利，D1P1组12小时死亡1只，解剖证实死亡原因为大面积PTE。2．VTE（DVT-PTE）时循环和呼吸病理生理改变：D1P1、D7P4组mPAP和mRVP升高，与Sham组比较差异有显著性（p＜0.05）。D4P4、D4P7、D7P1、D7P4和D7P7组动脉血氧分压（PaO2）和混合静脉血氧分压（PvO2）降低，与Sham组比较差异有显著性（p＜0.05）。DVT或PTE的病程是mPAP、mRVP和PaO2的独立影响因素（p＜0.05），二者联合作用对上述指标的影响有显著性（p＜0.01）；DVT或PTE的病程不是PvO2的独立影响因素，但二者的联合作用对PvO2的影响有显著性（p＜0.01）。3．VTE（DVT-PTE）时栓塞与非栓塞血管的变化：DVT-PTE1天栓塞肺动脉的管壁面积与血管面积比值呈现下降趋势（0.52±0.05），第4和7天则出现升高趋势（分别为0.62±0.06和0.61±0.02），但与Sham组（0.57±0.01）比较，差异没有显著性。DVT-PTE组非栓塞肺动脉的管壁面积与血管面积比值增加，其中D1P7、D4P4、D7P4和D7P7组（分别为0.73±0.09；0.78±0.02；0.73±0.01；0.73±0.04）与Sham组（0.57±0.01）比较差异有显著性（p＜0.05）。4．大鼠VTE病理改变：D1、D4和D7组股静脉分别有红色、混合、机化血栓形成，混合（DVT 4天）和机化（DVT 7天）血栓栓塞肺动脉后，血栓溶解性降低，易发生机化，肺部炎症和肺泡出血面积增大，并累及近心端。D1组股静脉内皮细胞间连接断裂，内弹力板裸露，D4组股静脉内皮细胞肿胀、核增大，胞浆吞饮小泡增加，部分内皮细胞和内弹力板消失；D7组股静脉血管壁结构消失。红色（DVT 1天）和混合（DVT 4天）血栓栓塞肺动脉第4和7天肺动脉内皮细胞增生，内弹力板增厚；而机化（DVT 7天）血栓栓塞肺动脉则可在第1天（D7P1组）即出现肺动脉内皮细胞线粒体肿胀和内弹力板消失。5．VTE肺组织VEGF和bFGF的免疫组织化学分析：VEGF抗原：Sham组和DVT组主要在支气管上皮胞浆表达，DVT-PTE组第1天肺动脉平滑肌细胞和肺泡上皮细胞胞浆可见表达，第4天肺动脉内皮细胞胞浆可见表达，第4和7天机化栓子中成纤维细胞胞浆有表达。bFGF抗原：Sham组和DVT组主要由支气管平滑肌和肺动脉平滑肌细胞胞浆表达，DVT-PTE组第1天肺动脉平滑肌细胞胞浆表达增强，第4和7天肺动脉周围基质和机化栓子内成纤维细胞胞浆可见表达6．VTE肺组织和血清VEGF和bFGF的变化：VEGF：Sham组和DVT组肺组织均有VEGF mRNA和蛋白表达，二者差异无显著性；DVT-PTE组第1天（PTE1）肺组织VEGF mRNA表达即升高并达峰值，第7天（PTE7）仍高于Sham组（P＜0.05）；蛋白表达量在第1天（PTE1）升高（P＜0.05），尽管第7天（PTE7）仍高于基线值，但与Sham组比较差异不显著。VTE（DVT组和DVT-PTE组）时血清VEGF浓度与Sham组比较差异无显著性。bFGF：Sham组和DVT组肺组织均有bFGF mRNA和蛋白表达，二者差异无显著性；DVT-PTE组肺组织bFGF mRNA表达在第1天（PTE1）开始升高，蛋白表达量在第7天（PTE7）开始升高（p＜0.05）；血清bFGF浓度在D1组升高（p＜0.05），而在D7、D7P4和D7P7组降低（p＜0.05）。[结论]1．成功建立大鼠VTE模型：采用显微血管夹阻滞股静脉血流，可制备理想的DVT动物模型；将层状血栓从一侧股静脉取出后，经对侧股静脉注入可成功制备PTE动物模型；由于模拟人的DVT-PTE过程，因此是符合VTE病理生理的理想实验模型。2．大鼠DVT不同时期血栓栓子的性质直接影响PTE的转归：DVT不同时期血栓栓子的性质可直接影响PTE血栓的转归（溶解、机化、再通或继发血栓形成）以及肺动脉和肺组织的病理改变；混合血栓（DVT 4天）栓塞肺动脉第4和7天肺动脉内皮细胞增生，内弹力板增厚，而机化血栓（DVT7天）栓塞肺动脉第1天即可引起内皮细胞线粒体肿胀和内弹力板消失；DVT和PTE的病程及其相互作用可共同影响大鼠VTE的循环和呼吸病理生理变化。3．VEGF和bFGF可影响VTE血栓机化和血管内膜修复：大鼠VTE后VEGF和bFGF参与血栓机化过程；PTE后肺动脉和肺组织中VEGF和bFGF表达增加，反映了机体对血管内膜损伤的一种代偿性修复过程。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分 大鼠静脉血栓栓塞症模型的建立及其血管内膜的改变
• 一、前言
• 二、材料与方法
• 1、主要仪器和试剂
• 2、实验动物及分组
• 3、静脉血栓栓塞症模型的建立
• 4、数据采集及标本处理
• 5、肺组织切片HE染色及血管测量
• 6、统计学方法
• 三、结果
• 1、动物一般情况
• 2、动脉血气结果
• 3、肺动脉平均压力和平均右心室压力结果
• 4、血管及肺组织病理学
• 四、讨论
• 五、小结
• 参考文献
• 第二部分 静脉血栓栓塞症大鼠血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的变化
• 一、前言
• 二、材料与方法
• 1、主要仪器
• 2、主要试剂及制剂
• 3、免疫组化法对肺组织VEGF和bFGF表达的定位分析
• 4、免疫印迹法分析肺组织VEGF和bFGF蛋白含量
• 5、RT-PCR方法测定肺组织VEGF和bFGF mRNA表达
• 6、ELISA方法测定血清VEGF和bFGF浓度
• 三、结果
• 1、免疫组化结果
• 2、肺组织VEGF和bFGF蛋白含量结果
• 3、肺组织VEGF和bFGF mRNA表达结果
• 4、血清VEGF和bFGF浓度结果
• 四、讨论
• 五、小结
• 参考文献
• 综述、慢性血栓栓塞性肺动脉高压基础研究进展
• 致谢