利用基因枪法和花粉管通道法转化抗旱相关基因的研究

论文摘要

玉米是我国重要的粮食兼饲料作物,在农业生产中占有越来越重要的地位。低温、干旱、盐碱等逆境条件严重影响玉米的质量和产量,其中干旱胁迫是影响玉米产量最主要的非生物胁迫因素之一。据统计,我国玉米种植面积的2/3为旱作玉米。利用转基因技术,建立玉米遗传转化体系,将抗旱相关基因导入优良玉米自交系,培育耐旱玉米品种,以满足社会对玉米的需求。蛋白激酶是一类依赖胞内信使的、在蛋白质磷酸化过程中起中介和放大作用的、帮助完成信号传递过程的酶,它们在植物胁迫信号转导中发挥着重要作用,已发现多种蛋白激酶家族参与调节植物干旱、高盐和低温等的信号转导。本人所在实验室从玉米中克隆了三种蛋白激酶基因即ZmCIPK2、ZmPti1和ZmPti1-1,并证明了这三种基因能够在玉米中被逆境诱导表达,Os07G0622000基因和AK072466基因都是水稻蛋白激酶基因家族的成员,已有的实验结果证实它们与植物抗性密切相关。本研究以优良玉米自交系501、吉444和京24为材料,采用基因枪法和花粉管通道法将抗旱相关基因导入玉米自交系进行初步研究。主要研究结果如下:1.以玉米自交系501的幼胚和愈伤组织作为受体,用基因枪的方法转化pCI-AK072466-hpt和pCI-Os07G0622000-hpt,经过抗性筛选、分化、植株再生、移栽、检测,最后认为幼胚更适合作为基因枪转化的受体材料,501幼胚和愈伤组织两种受体最终分别获得15棵、2棵转基因植株,平均转化率分别为1.67%、0.19%。2.利用花粉管通道法将ZmCIPK2、ZmPti1和ZmPti1-1三种蛋白激酶基因导入玉米自交系吉444,经PCR检测,获得1.33%的转化率。通过对转基因植株T1代的单株籽粒产量和千粒重进行分析,初步鉴定转基因植株的耐旱性有一定的提高。3.玉米自交系吉444为材料,通过花粉管通道法转化pCI-Os07G0622000-hpt,对T1代的转基因幼苗在三叶期进行PEG-6000模拟干旱胁迫处理,通过测定叶片相对含水量和叶片细胞离子渗漏率,初步鉴定转基因植株的耐旱性有一定的提高。4.构建了pGreen0229-Os07G0622000-bar植物表达载体,并用花粉管通道法进行了自交系京24转化,最后获得了4个抗除草剂且PCR验证的转基因株系。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 研究的目的和意义
• 1.2 文献综述
• 1.2.1 玉米遗传转化的方法
• 1.2.2 玉米遗传转化的受体系统
• 1.2.3 玉米遗传转化的标记基因
• 1.2.4 玉米的抗旱研究
• 1.2.5 干旱对植物的影响
• 1.2.6 玉米转基因技术的展望
• 2 材料与方法
• 2.1 基因枪法转化玉米自交系501的材料与方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 试验方法
• 2.2 花粉管通道法转化zmpti1,zmpti1-1,zmcipk2蛋白激酶基因的材料与方法
• 2.2.1 试验材料
• 2.2.2 试验方法
• 2.3 花粉管通道法转化os07g0622000基因的研究的材料与方法
• 2.3.1 试验材料
• 2.3.2 试验方法
• 2.4 pgreen0229-os07g0622000-bar植物表达载体的构建与转化的材料与方法
• 2.4.1 试验材料
• 2.4.2 试验方法
• 3 结果与分析
• 3.1 基因枪法转化玉米自交系501
• 3.1.1 玉米501幼胚的诱导及抗性愈伤组织的筛选
• 3.1.2 抗性愈伤组织分化及再生植株的获得
• 3.1.3 转基因植株的pcr检测
• 3.2 花粉管通道法转化zmpti1,zmpti1-1,zmcipk2蛋白激酶基因
• 3.2.1 花粉管转化及转化植株的筛选
• 3.2.2 转基因植株的pcr检测
• 3.2.3 玉米t1代的抗旱性初步鉴定
• 3.3 花粉管通道法转化os07g0622000基因的研究
• 3.3.1 花粉管转化及转化植株的筛选
• 3.3.2 转基因植株的pcr检测
• 3.3.3 转基因植株的确定
• 3.3.4 转基因植株的胁迫处理
• 3.3.5 干旱胁迫下叶片相对含水量的变化
• 3.3.6 干旱胁迫下细胞膜的稳定性
• 3.4 pgreen0229-os07g0622000-bar表达载体的构建与转化
• 3.4.1 植物表达载体的构建
• 3.4.2 花粉管通道法转化及抗性植株的筛选
• 3.4.3 转基因植株的pcr检测
• 4 讨论
• 4.1 基因枪法转化玉米自交系501
• 4.1.1 影响基因枪转化频率的因素
• 4.1.2 影响玉米组织培养的因素
• 4.2 花粉管通道法转化zmpti1,zmpti1-1,zmcipk2蛋白激酶基因
• 4.2.1 zmpti1,zmpti1-1,zmcipk2蛋白激酶基因
• 4.2.2 花粉管通道法转化玉米的方法
• 4.2.3 转基因玉米耐旱性的鉴定
• 4.3 花粉管通道法转化os07g0622000基因的研究
• 4.3.1 os07g0622000基因
• 4.3.2 干旱胁迫对玉米叶片相对含水量和细胞离子渗漏率的影响
• 4.4 pgreen0229-os07g0622000-bar表达载体的构建与转化
• 4.4.1 植物表达载体的构建
• 4.4.2 转基因玉米标记基因
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文