靶向VEGF基因的microRNA真核表达载体的构建及其功能鉴定

论文摘要

目的：血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）是一种重要的促血管生成因子，它可以通过自分泌的形式促进肿瘤细胞自身的生长，在肝癌的发生、发展、转移及预后等诸多方面均起着至关重要的作用。如何有效的抑制VEGF基因的表达已经成为治疗肿瘤的关键所在。MicroRNA（miRNA）是一种广泛存在的非编码小RNA，通过与其靶基因3’UTR中的靶序列互补配对结合，在翻译水平负向调控靶基因的表达，具有抑癌基因和癌基因的功能，补充并丰富了肿瘤的发生机制。最近大量的研究提示，通过借助miRNA的表达框架，可以将靶向特定基因的人工合成的外源性miRNA导入细胞内，实现抑制目的靶基因的效果。因此，本实验研究构建了靶向VEGF基因的外源性MicroRNA表达载体，瞬时转染肝癌HepG2细胞，观察外源性MicroRNA介导的RNA干扰能否阻断VEGF基因的表达，通过测定靶基因的抑制程度和VEGF蛋白的降低程度，并从中挑选出抑制效果最佳的序列，从而了解靶向VEGF基因的外源性MicroRNA的表达对VEGF基因表达的影响。方法（1）序列设计合成：从GenBank上搜索获得VEGF基因（Genebank ID：NM001025366）的mRNA序列，应用Invitrogen公司提供的在线软件，设计4对针对VEGF基因的pre-microRNA寡核苷酸序列，并得到其互补序列，经NCBI Blast排除其非特异同源性。同样设计一段阴性对照序列（Neg），该阴性对照不针对人体任何mRNA序列。（2）真核载体构建：合成上述设计好的序列，分别构建入pcDNA6. 2-GW / EmGFP miR真核表达载体并转化至DH5α感受态大肠杆菌。对经过初步鉴定的阳性克隆提取质粒并纯化、测序。重组体分别命名为VEGF-miRNA-1，VEGF-miRNA-2，VEGF-miRNA-3，VEGF-miRNA-4，VEGF-miRNA- Neg。（3）肝癌细胞转染：采用脂质体转染法将上述四组重组质粒分别转染至四组人肝癌细胞株HepG2细胞中，空白对照为单纯加Lipofectamine 2000。转染24小时后，通过倒置荧光显微镜观察HepG2细胞EmGFP的表达，以评估质粒转染效率。（4）验证转染效果：qPCR、Western-blot测定不同组之间肝癌细胞VEGF mRNA及VEGF蛋白的表达量的差异，从而验证miRNA-VEGF对靶基因的特异性抑制作用，并明确抑制作用最强的重组质粒及其所携带的miRNA序列。结果（1）成功构建了针对VEGFmRNA序列的4条MicroRNA真核表达载体；（2）干扰质粒转染肝癌HepG2细胞后，定量PCR检测显示，VEGF-miRNA-1、VEGF-miRNA-2、VEGF-miRNA-3、VEGF-miRNA-4干扰质粒对靶基因mRNA表达都有抑制作用，其中VEGF-miRNA-3干扰质粒抑制作用最显，抑制率达87%，与空白对照组相比，具有明显差异（P<0.05）；Western-blot方法检测各组细胞中VEGF蛋白表达水平显示，VEGF-miRNA-1、VEGF-miRNA-2、VEGF-miRNA-3干扰质粒对靶基因蛋白表达有抑制作用，其中VEGF-miRNA-3干扰质粒抑制作用最明显，抑制率达87%，与空白对照组相比，具有明显差异（P<0.05）。结论成功构建了靶向VEGF基因的MicroRNA真核表达载体，该表达载体可显著抑制HepG-2细胞中的VEGF基因的表达，为下一步肝癌的基因治疗提供了理论及实验依据。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略语
• 第1章 前言
• 第2章 材料与方法
• 2.1 主要试剂
• 2.2 细胞株、菌株与质粒
• 2.3 主要仪器
• 2.4 编码靶向VEGF 的pre-miRNA 寡核苷酸序列的设计合成
• 2.5 重组载体的构建、纯化及鉴定
• 2.6 细胞的培养及转染
• 2.7 qPCR 检测干扰载体对靶基因的干扰效果
• 2.8 VEGF 表达的Western blot 检测
• 2.9 统计学方法
• 第3章 实验结果
• 3.1 成功构建靶向VEGF 基因的miRNA 真核表达载体
• 3.2 肝癌细胞总RNA 鉴定
• 3.3 qPCR 检测干扰载体对靶基因的沉默效果
• 3.4 VEGF 基因的扩增曲线及溶解曲线
• 3.5 Western blot 检测干扰载体对靶基因蛋白表达水平的沉默效果
• 第4章 讨论
• 第5章 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 附录
• 致谢