论文摘要
骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是骨髓中的非造血干细胞，具有自我复制能力和多向分化潜能。在不同的条件下可以诱导分化为多个细胞系，包括成骨细胞、成纤维细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、内皮细胞及神经细胞等。骨髓间充质干细胞还具有取材方便，对机体损伤小，体外培养增殖能力强等优点，选用自体骨髓间充质干细胞进行组织再生或移植，不仅没有移植排异反应，还避免了伦理纷争。因此，对骨髓间充质干细胞的研究成为当今生物医学的热点，骨髓间充质干细胞也被认为是最有前途的组织工程的种子细胞。1 BMSCs的分离培养和生物学特性为了建立一个有效的分离培养，体外扩增的方法，本实验比较了三种常用的分离培养方法，结果显示用Percoll淋巴细胞分离液进行不连续密度梯度离心法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞能够在较短的时间内实现BMSCs的体外扩增和纯化。将得到的BMSCs在倒置相差显微镜下观察其形态，发现90％以上的细胞表现为BMSCs典型形态。用MTT法描绘细胞生长曲线证实细胞生长状况良好，且增殖状况与接种密度有关。用流式细胞仪鉴定第5和20代细胞表型，CD29、CD90、CD44、CD106、CD71表现为阳性，CD34、CD45为阴性，证明BMSCs稳定传至20代，表型没有变化。2 BMSCs向神经样细胞的诱导分化常用的诱导BMSCs向神经细胞分化的诱导方案是将成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）、二甲基亚砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）、丁羟基茴香醚（butyl hydroxy anisol，BHA）联用。本实验BMSCs分别用（1）bFGF+DMSO+BHA；（2）bFGF+DMSO；（3）DMSO+BHA；（4）DMSO四种不同的诱导方案诱导，发现用（1）诱导的BMSCs在29小时内有80％左右变成神经样细胞，而其他三组则需更长的时间。同时使用方案（1）时，细胞形态变化较其他三组变化更快，更明显。这四组诱导得到神经样细胞均可以表达神经特异性标志neuron-specific enolase（NSE）。用方案（1）29h可以得到80％细胞阳性，而此时其他各组基本为阴性表达。使用方案（2）（3）（4）需要32h左右可以观察到BMSCs形态变化成神经元样，免疫荧光染色约80％阳性。将各组诱导后的细胞继续用无血清L-DMEM培养24 h，发现用（3）（4）两种方案诱导得到的细胞出现老化死亡现象。为了检测这些神经特异标志在BMSCs向神经样细胞分化过程中的表达，将BMSCs用含血清和bFGF的L-DMEM预诱导24 h，然后用含有DMSO和BHA的无血清L-DMEM继续诱导。在这个过程中发现nestin的表达要早于NSE和β-tubulin的表达，因为nestin是神经干细胞的标志，而后两者是神经元的标志。最后，将BMSCs和用其诱导分化成的神经样细胞预先用BrdU标记，然后局部移植入脊髓横断的动物模型体内，用BBB评分来评价术后1-12 w动物的行为表现及功能恢复情况。结果显示移植细胞的动物整体功能恢复情况要好于对照组。用免疫组化法对横断部位脊髓切片染色也发现许多BrdU阳性的细胞。3 BMSCs向成骨细胞的诱导分化为了检测不同诱导起始时间对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响，开展了如下工作。分别在（1）BMSCs接种当时，（2）50-60％融合时，（3）85-95％融合时加入成骨诱导剂开始诱导。倒置相差显微镜下观察增殖分化情况，分别进行碱性磷酸酶染色（钙钴染色）和钙结节染色（von kossa染色）。诱导过程中可以观察到BMSCs逐渐向成骨细胞形态转变，碱性磷酸酶染色和钙结节染色呈现阳性。结果显示在BMSCs 85-95％融合时开始诱导的细胞碱性磷酸酶和钙结节染色阳性率更高而碱性磷酸酶活性增强更明显。为了评估不同传代倍数的BMSCs成骨诱导分化能力的高低，将5、10、15、20四代细胞同时开始向成骨细胞诱导，发现这四代细胞分化成成骨细胞的能力没有明显不同。本实验为进一步研究BMSCs向神经、成骨细胞分化的机制提供实验依据。
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