草菇开伞反义基因应用初探

论文摘要

为得到开伞行为受抑制的草菇新品种,本实验以草菇H104为受体菌株,将pCAMBLA1301导入,得到具有潮霉素抗性和GUS活性的转基因草菇H104。通过计算遗传转化率,优化了农杆菌C58介导转化H104的条件,得到:在菌丝培养3～4d、菌液的侵染浓度为OD600值0.5～0.6、AS浓度为100μM、共培养时间5d时转化效率最高。在此最优转化条件下,将带有草菇开伞反义基因opn39和草菇开伞正义基因opn15的质粒导入草菇H104,得到草菇转化子VC58-opn39和VC58-opn15,并通过出菇实验观察到草菇转化子VC58-opn39开伞行为受抑制的现象。但是,我们同时也观察到了VC58-opn15开伞行为受抑制的现象。这可能是由于质粒中的某些序列与草菇基因组中的某些序列具有同源性而导致非特异性沉默引起的,但是由于核酸数据库所提供的信息不足无法分析得出结论。为此,我们提取了H104的基因组DNA,并通过TAIL-PCR成功扩增出了opn基因片段两侧的序列,其中上游片段924bp,下游片段500bp,合并后共1106bp,并对其进行了生物信息学分析。进行ORF分析时,我们找到了包含opn基因片段的ORF,证明了前面实验的正确性;而进行blastn分析时,由于数据库匹配的信息较少,没有进一步预测高级结构。至此,草菇开伞相关基因的探索并未结束,后续工作仍然艰巨而又伟大。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 草菇介绍
• 1.1.1 草菇的栽培历史
• 1.1.2 草菇的生物学特性
• 1.1.3 草菇的生活史
• 1.1.4 草菇的营养价值及其栽培特点
• 1.1.5 草菇的品系及常见栽培品种
• 1.1.6 草菇的分布及生产
• 1.2 草菇的采后保鲜
• 1.3 反义基因技术
• 1.3.1 反义基因技术原理
• 1.3.2 反义基因技术研究进展
• 1.3.3 反义基因技术在控制生物性状上的应用
• 1.3.4 在动物及医学治疗上的应用
• 1.3.5 在植物上的应用
• 1.3.6 在真菌上的应用
• 1.4 TAIL-PCR
• 1.5 本研究的独创性及应用前景
• 第二章 农杆菌转化条件优化
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验试剂
• 2.2.1 寡聚核苷酸引物
• 2.2.2 常用溶液
• 2.2.3 酶与生化试剂
• 2.3 培养基
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 农杆菌转化
• 2.4.2 农杆菌介导的草菇遗传转化
• 2.4.3 转化子的PCR鉴定
• 2.5 结果与分析
• 2.5.1 抗性梯度预实验
• 2.5.2 抗药性基因转农杆菌
• 2.5.3 农杆菌侵染草菇的条件优化
• 2.5.4 小结
• 2.6 讨论
• 第三章 反义基因导入草菇
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验试剂
• 3.3 培养基
• 3.4 实验方法
• 3.4.1 C58-OPN39侵染与转化子筛选
• 3.4.2 潮霉素浓度梯度复筛鉴定转化子
• 3.4.3 转化子的PCR鉴定
• 3.4.4 GUS表达活性鉴定
• 3.4.5 用以上同样方法转入OPN15质粒
• 3.4.6 出菇实验
• 3.5 结果与分析
• 3.5.1 C59-OPN39侵染与转化子筛选
• 3.5.2 潮霉素浓度梯度复筛鉴定转化子
• 3.5.3 转化子的PCR鉴定
• 3.5.4 GUS表达活性鉴定
• 3.5.5 VC58-OPN15验证结果
• 3.5.6 出菇实验
• 3.6 讨论
• 第四章 TAIL-PCR
• 4.1 实验材料
• 4.2 实验试剂
• 4.2.1 常用溶液
• 4.2.2 酶与生化试剂
• 4.3 培养基
• 4.4 实验方法
• 4.4.1 菌丝培养
• 4.4.2 CTAB法提取DNA（参见第二章"实验与方法"）
• 4.4.3 TAIL-PCR
• 4.4.4 克隆与测序
• 4.5 结果与分析
• 4.5.1 CTAB法提取DNA
• 4.5.2 TAIL-PCR
• 4.5.3 阳性克隆的检测（菌落PCR）
• 4.5.4 测序结果
• 第五章 生物信息学分析
• 5.1 实验方法
• 5.1.1 去掉引物序列
• 5.1.2 ORF分析
• 5.1.3 ORF与核酸数据库进行序列比对
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 ORF分析结果
• 5.2.2 BLASTN序列比对
• 5.3 讨论
• 参考文献:
• 致谢