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我国斑点叉尾鮰种质资源的分子遗传学研究

2020-12-01阅读(897)

我国斑点叉尾鮰种质资源的分子遗传学研究

论文摘要

斑点叉尾鮰( Ictalurus punctatus)属脊索动物门(Chordata),辐鳍鱼纲(Actinopterygii),新鳍鱼亚纲(Neopterygii),鲇形目(Siluriformes),北美鲶科(Ictaluridae),叉尾鮰属(Ictalurus)。原产于美国和墨西哥北部,1984年引进我国,经多年养殖推广,已遍及全国20多个省、市、自治区。由于引进后多年累代养殖,没有经过认真的选育,所以目前种质退化现象严重。主要表现为抗病力下降、生长缓慢等,并且高密度集约化养殖时易发生大规模病害和死亡,是造成当前国内鮰鱼养殖效益不佳的主要原因之一。为进一步提高养殖鮰鱼的产量和质量,保证鮰鱼养殖业的可持续发展,进行斑点叉尾鮰遗传育种改良,遗传分化、遗传多样性水平,特别是主要养殖性状退化的分子遗传学机制已成为人们关注的课题。DNA分子标记所具有的稳定性、准确性和可靠性使其能够准确的反映生物的遗传信息。本文利用AFLP和SSR两种分子标记对中国1984年、1997年、2004年引进的斑点叉尾鮰群体以及1984年和1997年群体杂交的F1代群体的遗传多样性进行研究,以期为斑点叉尾鮰的苗种繁育、种质资源的保存和利用以及种质鉴定等工作提供一定的理论基础。本实验共筛选了10对AFLP引物以及10对SSR引物,对4个群体的120个(每个群体30个个体)斑点叉尾鮰进行了研究。利用Popgen 32软件分析了群体内的遗传变异和群体间的遗传结构,计算不同地理种群的遗传距离,用UPGMA法构建了4个群体的系统发生树。两种方法所得的结果如下:利用10对AFLP引物共扩增出523个位点,其中有243个多态性位点,平均每个引物扩增出24.3个多态性的位点。10对SSR引物共扩增出35个等位基因,平均每个位点为3.5个。在检测遗传变异时两种方法都表明4个群体都具有中等的遗传多样性。而且,SSR检测到的变异性都高于AFLP标记的检测结果。两种方法检测的有效等位基因数(Ne)分别为1.2026(AFLP)和2.1098 (SSR),AFLP检测到的杂合度Nei(H)指数分布在0.0781和0.1137之间;SSR检测的观测杂合度分布在0.4768和0.5982之间。用SSR方法分析时发现,群体总的观测杂合度(Ho=0.5249)明显的高于期望杂合度的值(He = 0.5161),存在杂合度过剩的现象。两种方法所得的4个群体的遗传多样性顺序有一定差别,4个群体的遗传多样性参数由大到小依次为:AFLP法:P8497、P1997、P2004、P1984;SSR: P2004、P1997、P8497、P1984。其中P1984群体的遗传多样性各参数在所有群体中都是最低的。利用AFLP分析的群体间的遗传分化度(Gst)为0.0957,各群体间的Gst分布在0.0798～0.1192之间;SSR测得的群体间总的近交系数(Fst)为0.0196,说明群体内总的遗传分化中有1.96﹪是来自群体间的遗传变异。同时利用Gst和Fst得出的群体内总的Nm分别为4.8404(AFLP)和23.3290(SSR),证明各群体间基因流动性很好。利用两种方法计算的4个群体的遗传距离分布在0.0079～0.0158(AFLP)之间和0.0066～0.0632(SSR)之间。基于遗传距离所构建的系统发生树表明,4个群体共分为了三个组:P1997和P2004首先聚为一类,再与P8497聚为一支,而P1984单独成为一支。通过对斑点叉尾鮰的遗传变异和遗传结构的分析,比较了两种分子标记在研究群体遗传多样性中的优越性。结果表明,SSR技术的多态信息含量以及有效等位基因数等遗传变异参数明显高于AFLP技术,但是,AFLP能够获得比SSR技术更高效的多态位点数检出率。AFLP标记主要检测的是核基因组编码区与非编码区DNA序列上的差异,而SSR标记主要检测的是基因组DNA非编码区重复数上的差异,实验的结果表明,两种分子标记都是研究斑点叉尾鮰种群多样性的有力工具。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第1章 前言
  • 1.1 斑点叉尾鮰概况
  • 1.1.1 斑点叉尾鮰目前存在问题
  • 1.1.2 斑点叉尾鮰的生物学研究
  • 1.1.3 斑点叉尾鮰在我国的养殖情况
  • 1.1.4 斑点叉尾鮰国内外研究现状
  • 1.2 种质资源及其遗传多样性的概念及意义
  • 1.3 种质资源及其遗传多样性研究的方法与技术
  • 1.3.1 形态学标记
  • 1.3.2 细胞学（染色体）标记
  • 1.3.3 同工酶标记
  • 1.3.4 DNA 分子标记
  • 1.4 DNA 分子标记简介
  • 1.4.1 DNA 分子标记的特点
  • 1.4.2 分子标记的系统分类
  • 1.4.3 AFLP分子标记技术
  • 1.4.3.1 AFLP 技术的基本原理
  • 1.4.3.2 AFLP 的实验步骤简介
  • 1.4.3.3 AFLP 标记的优点
  • 1.4.4 微卫星分子标记技术
  • 1.4.4.1 微卫星标记的定义和结构类型
  • 1.4.4.2 微卫星遗传标记的主要步骤
  • 1.4.4.3 微卫星标记的优点
  • 1.5 研究斑点叉尾鮰遗传多样性的目的与意义
  • 第2章 材料与方法
  • 2.1 实验材料
  • 2.2 实验器材以及实验药品
  • 2.2.1 实验器材
  • 2.2.2 主要药品以及相关试剂的配制
  • 2.2.2.1 DNA提取主要试剂
  • 2.2.2.2 AFLP 以及SSR 实验主要药品及相关试剂的配制
  • 2.3 实验方法
  • 2.3.1 实验的主要流程图
  • 2.3.2 基因组DNA的提取以及纯化
  • 2.3.3 AFLP技术实验流程与产物的检测
  • 2.3.3.1 模板 DNA 浓度的调整
  • 2.3.3.2 AFLP 的引物筛选
  • 2.3.3.3 模板的酶切及接头的连接
  • 2.3.3.4 AFLP 的DNA 片断的预扩
  • 2.3.3.5 AFLP 的选择性扩增
  • 2.3.3.6 AFLP 产物的检测
  • 2.3.4 SSR技术实验流程与产物检测
  • 2.3.4.1 SSR 引物的设计与筛选
  • 2.3.4.2 SSR 的PCR 反应体系
  • 2.3.4.3 SSR 的PCR 反应体系条件摸索
  • 2.3.4.4 SSR 的PCR 扩增
  • 2.3.4.5 SSR 产物的琼脂糖凝胶电泳检测
  • 2.3.4.6 SSR 产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的检测
  • 2.3.5 数据处理与分析
  • 2.3.5.1 群体内遗传变异
  • 2.3.5.2 群体间的遗传关系
  • 第3章 结果
  • 3.1 斑点叉尾鮰的总DNA提取
  • 3.2 AFLP技术实验结果
  • 3.2.1 酶切DNA浓度的调整
  • 3.2.2 AFLP引物的筛选
  • 3.2.3 AFLP选择性扩增的结果
  • 3.2.4 斑点叉尾鮰群体遗传多样性的AFLP数据分析
  • 3.2.4.1 斑点叉尾鮰4个群体内遗传多样性的分析
  • 3.2.4.2 斑点叉尾鮰4个群体间的遗传分化分析
  • 3.2.4.3 斑点叉尾鮰4 个群体间的遗传距离、遗传相似度以及聚类分析
  • 3.2.4.4 斑点叉尾鮰不同群体间潜在的群体鉴别差异片段分析
  • 3.3 SSR技术实验结果
  • 3.3.1 SSR引物的筛选与退火温度的摸索结果
  • 3.3.2 模板浓度的摸索结果
  • 3.3.3 斑点叉尾鮰 SSR 产物琼脂糖凝胶电泳检测结果
  • 3.3.4 SSR产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果
  • 3.3.5 斑点叉尾鮰群体遗传多样性的 SSR 数据分析
  • 3.3.5.1 斑点叉尾鮰不同群体内的遗传多样性分析
  • 3.3.5.2 斑点叉尾鮰不同群体内的 Hardy-Weinberg 平衡检测
  • 3.3.5.3 斑点叉尾鮰不同群体间的遗传变异的检测
  • 3.3.5.4 斑点叉尾鮰不同群体间的遗传距离、遗传相似度以及聚类分析
  • 第4章 讨论
  • 4.1 斑点叉尾鮰的群体遗传多样性分析
  • 4.1.1 AFLP标记分析群体遗传多样性
  • 4.1.2 SSR标记分析群体遗传多样性
  • 4.1.3 群体遗传多样性水平不高的原因
  • 4.2 种群的遗传结构
  • 4.3 系统发生与群体分化
  • 4.4 AFLP、SSR 标记比较分析
  • 4.4.1 两种研究的实验样本组成
  • 4.4.2 两种研究的遗传多样性分析
  • 4.4.3 群体遗传结构与分化比较
  • 4.4.4 各群体间关系和聚类结果比较
  • 4.5 关于EST-SSR 分子标记
  • 4.6 AFLP 和SSR 实验方法的优化
  • 4.6.1 引物的筛选
  • 4.6.2 PCR反应体系的优化
  • 4.6.3 关于SSR 在PAGE电泳中的影子带处理
  • 4.7 AFLP 和SSR 方法应用于斑点叉尾鮰群体遗传多样性的实用性和意义
  • 第5章 结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 附录
  • AFLP 部分实验结果
  • 研究生期间论文发表情况

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