MicroRNA-10b通过下调靶基因KLF4的表达促进人食管癌细胞的侵袭转移

论文摘要

MicroRNAs是一类内源性的非编码RNA,其大小约21个核苷酸。在哺乳动物细胞中,microRNA通过碱基之间的不完全互补配对识别靶基因的mRNA,根据互补程度的不同,降解靶mRNA或抑制靶mRNA的翻译。目前研究证明,miRNAs在细胞生长、分化和凋亡中起着非常重要的作用。最近研究显示,microRNA可以作用于肿瘤转移相关的多条信号通路,以此调节肿瘤的转移。首先,通过实时定量RT-PCR实验,分析了8种人食管鳞状细胞癌（ESCC）细胞系中的miR-10b表达水平,发现不同细胞内miR-10b表达水平存在较大差异。接下来通过transwell实验分析了以上8种细胞的侵袭迁移能力,经统计学分析发现miR-10b表达水平的高低与细胞的侵袭迁移能力密切相关。为了检测miR-10b是否影响人ESCC细胞的侵袭迁移能力,在KYSE140细胞中过表达和在EC9706细胞中敲降miR-10b。我们发现在KYSE140细胞中过表达miR-10b可以促进细胞的侵袭迁移能力,在EC9706细胞中敲降miR-10b可以抑制细胞的侵袭能力,而并不影响细胞的迁移能力。接下来我们探索了miR-10b作用的分子机制。生物信息学软件分析预测KLF4是miR-10b的靶基因。KLF4作为转录因子参与细胞周期调节,细胞凋亡和分化；DNA损伤,血清饥饿和接触抑制均可刺激KLF4表达增加。最近研究发现,在人ESCC细胞系TE2细胞中,KLF4可以抑制细胞的侵袭和迁移。此外,in vivo实验显示KLF4能够抑制胰腺癌细胞转移,在直肠癌细胞RKO细胞中过表达KLF4可以抑制细胞的侵袭迁移。我们分别构建了含有KLF4 mRNA的全长3’UTR的报告基因质粒和核心结合位点4个碱基突变的报告基因质粒。通过双荧光素酶报告基因实验,发现KLF4是miR-10b的直接靶基因。在KYSE140和KYSE450细胞中过表达miR-10b可以使内源KLF4蛋白水平降低,在EC9706细胞中敲降miR-10b引起KLF4蛋白水平升高。而且通过放线菌素D处理,测定miR-10b过表达时KLF4半衰期的改变,发现miR-10b对KLF4蛋白的半衰期并无影响。MiR-10b对KLF4表达水平的影响是通过转录后抑制途径。然后,我们在KYSE140细胞和EC9706细胞中验证了KLF4对细胞的侵袭迁移能力的影响。在KYSE140细胞中通过siRNA敲降KLF4促进细胞的侵袭和迁移,而在EC9706细胞中过表达KLF4下调细胞的侵袭迁移能力。说明KLF4对人类ESCC（?）田胞侵袭迁移能力的负调节作用。我们在KYSE140细胞中共表达miR-10b和KLF4,以及在EC9706细胞中同时敲降miR-10b和KLF4,均可以使miR-10b对细胞侵袭迁移能力的作用受到部分抑制。因此我们认为KLF4是tniR-10b的直接和功能性靶基因。最后,通过实时定量RT-PCR分析40对人ESCC标本中miR-10b的表达水平,我们发现miR-10b在95%（38/40）的食管癌组织中高表达。但是在这些标本中,miR-10b表达水平的高低与食管癌是否发生转移无关。

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