抗菌肽B在奶山羊乳腺上皮细胞系中的高效表达

论文摘要

本研究旨在通过基因重组技术构建真核表达载体,使天蚕素CecropinB基因在奶山羊乳腺上皮细胞中表达,建立抗菌肽防治哺乳动物乳腺炎的转基因技术基础。另外本研究所构建的真核表达载体含有报告基因EGFP的全部序列,其下游的调控序列两端带有限制性酶切位点,可为以后研究不同的真核基因调控序列提供方便可靠的模型。本实验从免疫的家蚕蛹中提取总RNA,反转录获得cDNA,以此cDNA为模板,PCR扩增目的基因片段,获得长为340bp的天蚕素CecropinB的DNA片段,与预期的目的片段大小一致。将天蚕素CecropinB基因片段克隆到pMD18-T载体上,经双酶切鉴定出的阳性克隆进行测序,将测序结果与GeneBank上的基因进行同源性比较、分析,结果同源性为100%。将所得的pMD18-B质粒用相应的限制性内切酶切成粘性末端,回收后与同两种酶双切的pECFP-C1质粒粘端进行连接,筛选阳性重组子,依此方法构建了真核表达载体pECFP-B。用胶原酶消化法对奶山羊乳腺上皮细胞进行了分离培养,并用免疫荧光染色法测定了乳腺上皮细胞中角蛋白18的表达,从而鉴定出分离培养的细胞为奶山羊乳腺上皮细胞。用阳离子脂质体把载体pECFP-B转入奶山羊乳腺上皮细胞,所转入的质粒中带有EGFP报告基因,能够表达荧光蛋白,在荧光倒置显微镜下可看到绿色的荧光。分别在mRNA水平上和蛋白活性水平上检测抗菌肽CecropinB的表达情况,通过RT-PCR方法和抑菌圈活性检测方法分别证明抗菌肽CecropinB可以在奶山羊乳腺上皮细胞中进行表达。本实验初步建立了抗菌肽防治奶山羊乳腺炎的转基因技术,重组质粒上还有Neo抗性基因,因此利用G418对转染后的细胞进行抗性筛选,先用高浓度(800μg·mL-1)后用低浓度(200μg·mL-1)维持,一个月后,筛选出阳性细胞株,从而证明抗菌肽B能在奶山羊乳腺上皮细胞中稳定持续表达。实验还检测了转染后不同时间抗菌肽的表达量,分别取了转染后3d、7d、14d、21d和30d细胞破碎液用平板扩散法检测生物活性,以未转染的同时期细胞做空白对照,结果表明随着时间的延长,细胞内抗菌肽的表达量也有所增加,也间接证明了CecropinB基因可以随着细胞的增殖而传代。将重组质粒pECFP-B用注射器直接注入正常奶山羊和患乳腺炎的奶山羊乳腺组织中,观察抗菌肽的表达情况,结果正常的奶山羊的乳汁对金黄色葡萄球菌有杀灭作用,而对患病的奶山羊有抑制乳腺炎发展的效果。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 抗菌肽简介
• 1.2 抗菌肽的杀菌机理
• 1.2.1 "桶板"模型
• 1.2.2 "毡毯"模型
• 1.3 抗菌肽的生物学功能
• 1.3.1 抗菌肽对细菌的作用
• 1.3.2 抗菌肽对原虫作用
• 1.3.3 抗菌肽对真菌的作用
• 1.3.4 抗病毒作用
• 1.3.5 抗肿瘤作用
• 1.4 抗菌肽的生物技术
• 1.4.1 用基因工程的方法生产抗菌肽
• 1.4.2 抗菌肽分子的设计和改造
• 1.5 抗菌肽应用前景展望
• 1.5.1 医药领域
• 1.5.2 食品和化妆品领域
• 1.5.3 畜牧业领域
• 1.5.4 农业领域
• 1.6 乳腺炎及其防治
• 1.7 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 主要器材和试剂
• 2.1.1 实验器材
• 2.1.2 实验试剂
• 2.1.3 实验动物
• 2.1.4 引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 样品获取
• 2.2.2 总RNA的提取
• 2.2.3 RT-PCR扩增CecropinB基因
• 2.2.4 PCR扩增产物连接T载体
• 2.3 真核表达载体pECFP-B的构建
• 2.3.1 材料和仪器
• 2.3.2 实验方法
• 2.4 细胞培养
• 2.4.1 主要器材和试剂
• 2.4.2 实验方法
• 2.5 细胞转染及表达产物的检测
• 2.5.1 材料和仪器
• 2.5.2 实验方法
• 2.6 抗菌肽B在奶山羊乳腺组织中的表达
• 2.6.1 抗菌肽在正常奶山羊乳腺组织中的表达
• 2.6.2 抗菌肽在患乳腺炎的奶山羊乳腺组织中的作用
• 3 结果与分析
• 3.1 蚕蛹总RNA的提取
• 3.2 CecropinB基因的克隆、鉴定与序列测定
• 3.2.1 CecropinB基因的PCR扩增
• 3.2.2 重组子pMDl8-B的PCR及双酶切鉴定
• 3.2.3 蚕蛹CecropinB基因的序列测定
• 3.2.4 真核表达重组子pECFP-B的PCR鉴定
• 3.3 山羊乳腺上皮细胞的分离培养及鉴定
• 3.3.1 山羊乳腺上皮细胞的分离培养
• 3.3.2 山羊乳腺上皮细胞的鉴定
• 3.4 表达产物的检测
• 3.4.1 报告基团荧光检测
• 3.4.2 抗菌肽在转染细胞中mRNA水平上的检测
• 3.4.3 平板扩散法检测生物活性
• 3.4.4 CecropinB基因在奶山羊乳腺上皮细胞中的稳定表达
• 3.4.5 转染后不同时期表达情况的检测
• 3.5 抗菌肽B在奶山羊乳腺组织中的表达
• 3.5.1 抗菌肽B在正常奶山羊乳腺组织中的表达
• 3.5.2 抗菌肽在患乳腺炎的奶山羊乳腺组织中的作用
• 4 讨论
• 4.1 CecropinB基因的获得
• 4.1.1 总RNA的提取
• 4.1.2 RT-PCR
• 4.2 真核表达载体的构建
• 4.3 奶山羊乳腺上皮细胞的分离培养和细胞转染
• 4.4 转基因技术防治哺乳动物乳腺炎的前景展望
• 4.4.1 CecropinB基因抗奶山羊乳腺炎的效果分析
• 4.4.2 转基因技术防治哺乳动物乳腺炎的前景
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文