阿尔茨海默病细胞损伤的相关机制及加兰他敏的神经保护作用研究

论文摘要

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是一种进行性中枢神经系统退行性疾病。其主要病理变化是脑内胆碱能神经元大量丢失和死亡。研究表明在AD病人脑组织中有大量p淀粉样蛋白（Aβ）沉积。作为细胞存活和功能的重要细胞器,以往研究已经证实线粒体的形态、运动和功能在AD时会受到影响,但关于其运动的长时程连续动态研究尚未见报道。另外,研究也表明AD病人脑内存在胆碱能系统功能异常,而囊泡乙酰胆碱转运体（vesicular acetylcholine transporter, VAChT）是胆碱能神经系统的重要组成部分,已有文献通过免疫组化和放射免疫方法证实AD病人脑内VAChT表达降低,但关于该囊泡的细胞内运动过程及在疾病中的作用的研究较少,且研究手段较单一。根据AD的相关病理变化和发病机制,目前临床上主要采用胆碱酯酶抑制剂治疗AD,加兰他敏就是其中的一种。关于其作用机制,已有研究证实它能够抑制Ap聚集、氧化应激和神经元凋亡等。但是,加兰他敏具体的神经保护机制还没有完全清楚,有待进一步探讨。本论文首先用Ap蛋白活性片段Aβ25-35诱导高分化PCI2细胞凋亡建立AD体外细胞模型,确定20μM Aβ25-35作用24 h为造模的最佳条件。然后在该模型基础上,利用激光共聚焦显微技术、流式细胞术、荧光酶标仪、活细胞工作站、全内反射荧光显微镜（TIRFM）、荧光染料染色、质粒转染、分子生物学技术和计算机图像处理等,对Aβ25-35诱导PC12细胞线粒体运动和功能变化、VAChT运动和蛋白表达变化及加兰他敏的神经保护机制进行了研究。结果发现：（1）Aβ25-35可以诱导PC12细胞线粒体形态运动和功能异常,在Aβ25-35作用早期,线粒体动力学改变是可逆的,依赖于暴露的时间和药物浓度；（2）正常情况下PC12细胞中单个囊泡在膜融合之前的转运,发现VAChT囊泡的运动主要有3种类型,分别为单个囊泡沿一条轨迹长距离运动、多个囊泡沿同一条轨迹运动和单个囊泡沿一条轨迹的双向往返运动,且以第1种运动类型最为常见。在此基础上进一步研究了Aβ25-35对VAChT运动的影响,发现20μM Aβ25-35作用24 h能明显抑制VAChT运动。同时检测到Aβ25-35能显著抑制VAChT蛋白的表达；（3）加兰他敏能抑制Aβ25-35聚集、Aβ25-35诱导的内质网钙释放、内质网应激相关蛋白GADD153和Grp78/94表达上升和下游的caspase-12活化增加。另外加兰他敏也能抑制Aβ25-35诱导的线粒体膜电位崩解、ROS产生、细胞色素c释放、Bcl-2/Bax比值下降和随后的caspase-9活化,最终抑制caspase-3活化,降低细胞凋亡。以上结果提示线粒体和VAChT在AD发生过程中起了重要作用,并且加兰他敏通过线粒体和内质网两条通路发挥了抗凋亡及神经保护作用；为进一步理解AD的病理机制提供了理论基础,也为相关药物研发提供了新的药物靶点。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 目录
• 缩略语词表
• 第1章 绪论
• 1.1 阿尔茨海默病的研究概况
• 1.1.1 阿尔茨海默病概述
• 1.1.2 AD的病理及临床表现
• 1.1.3 AD的病因发病机制
• 1.1.4 AD的模型研究进展
• 1.1.5 AD的治疗进展
• 1.2 AD中线粒体功能和运动的研究进展
• 1.2.1 线粒体概述
• 1.2.2 AD中线粒体功能研究进展
• 1.2.3 AD中线粒体运动研究进展
• 1.3 中枢神经系统中囊泡乙酰胆碱转运体的研究概况
• 1.3.1 VAChT基因及其编码蛋白
• 1.3.2 VAChT在中枢神经系统的分布及细胞定位
• 1.3.3 VAChT的功能
• 1.3.4 VAChT的转运
• 1.3.5 VAChT异常与疾病
• 1.3.6 VAChT的抑制剂
• 1.4 AD中加兰他敏研究概况
• 1.4.1 加兰他敏概述
• 1.4.2 加兰他敏在AD中的药理作用研究概况
• 1.5 本课题的研究目的、意义及内容
• 1.5.1 研究目的及意义
• 1.5.2 研究内容
• 第2章 Aβ诱导PC12细胞凋亡建立AD细胞模型
• 2.1 前言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 主要仪器及试剂
• 2.2.2 细胞培养
• 2.2.3 实验分组
• 2.2.4 MTT检测细胞存活率
• 2.2.5 Hoechst 33342染色观察细胞形态变化
• 2.2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡
• 2.2.7 统计分析
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 Aβ对PC12细胞存活率的影响
• 2.3.2 Aβ诱导PC12细胞形态改变
• 2.3.3 Aβ诱导PC12细胞凋亡
• 2.4 分析和讨论
• 第3章 Aβ诱导PC12细胞线粒体功能和运动异常
• 3.1 前言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 主要仪器及试剂
• 3.2.2 感受态细胞的制备
• 3.2.3 质粒转化
• 3.2.4 超纯质粒提取
• 3.2.5 细胞培养
• 3.2.6 稳定表达pDsRed2-Mito质粒的PC12细胞系的建立
• 3.2.7 实验分组
• 3.2.8 细胞线粒体膜电位的检测
• 3.2.9 细胞内活性氧的检测
• 3.2.10 细胞色素c释放的检测
• 3.2.11 Aβ诱导PC12细胞线粒体形态和运动异常的长时程动态观察
• 3.2.12 图像处理及结果分析
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 Aβ诱导PC12细胞线粒体膜电位下降
• 3.3.2 Aβ诱导PC12细胞内ROS产生增加
• 3.3.3 Aβ诱导PC12细胞内细胞色素c释放
• 3.3.4 Aβ诱导PC12细胞线粒体形态异常
• 3.3.5 Aβ诱导PC12胞线粒体运动异常
• 3.4 分析和讨论
• 第4章 Aβ诱导PC12细胞囊泡乙酰胆碱转运体表达和运动异常
• 4.1 前言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 主要仪器及试剂
• 4.2.2 感受态细胞的制备
• 4.2.3 质粒转染
• 4.2.4 超纯质粒提取
• 4.2.5 细胞培养
• 4.2.6 质粒转染
• 4.2.7 正常细胞中VAChT运动的TIRFM观察及图像处理
• 25-35对PC12细胞VAChT运动的影响'>4.2.8 Aβ_25-35对PC12细胞VAChT运动的影响
• 25-35对PC12细胞VAChT蛋白表达的影响'>4.2.9 Aβ_25-35对PC12细胞VAChT蛋白表达的影响
• 4.2.10 统计分析
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 VAChT囊泡运动类型
• 25-35抑制PC12细胞中VAChT囊泡运动'>4.3.2 Aβ_25-35抑制PC12细胞中VAChT囊泡运动
• 25-35抑制PC12细胞中VAChT蛋白表达'>4.3.3 Aβ_25-35抑制PC12细胞中VAChT蛋白表达
• 4.4 分析和讨论
• 第5章 加兰他敏对Ap诱导PC12细胞凋亡的神经保护作用及机制研究
• 5.1 前言
• 5.2 材料和方法
• 5.2.1 主要仪器及试剂
• 5.2.2 细胞培养
• 5.2.3 实验分组
• 5.2.4 MTT检测细胞存活率
• 5.2.5 刚果红（CR）染色
• 5.2.6 Thioflavin T（ThT）荧光测定
• 5.2.7 凋亡的定量分析
• 5.2.8 Hoechst 33342染色
• 5.2.9 线粒体和内质网的形态学观察
• 5.2.10 透射电镜
• 5.2.11 线粒体膜电位检测
• 5.2.12 细胞内ROS检测
• 2+]_i检测'>5.2.13 [Ca²⁺]_i检测
• 5.2.14 细胞色素c释放的检测
• 5.2.15 Western blot分析
• 5.2.16 统计分析
• 5.3 实验结果
• 25-35诱导的细胞活性降低'>5.3.1 加兰他敏减轻Aβ_25-35诱导的细胞活性降低
• 25-35聚集'>5.3.2 加兰他敏抑制Aβ_25-35聚集
• 25-35诱导的细胞凋亡'>5.3.3 加兰他敏减轻Aβ_25-35诱导的细胞凋亡
• 25-35诱导的细胞线粒体和内质网形态改变'>5.3.4 加兰他敏抑制Aβ_25-35诱导的细胞线粒体和内质网形态改变
• 25-35诱导的线粒体膜电位崩解'>5.3.5 加兰他敏减轻Aβ_25-35诱导的线粒体膜电位崩解
• 25-35诱导的ROS产生'>5.3.6 加兰他敏抑制Aβ_25-35诱导的ROS产生
• 25-35诱导的细胞色素c释放'>5.3.7 加兰他敏抑制Aβ_25-35诱导的细胞色素c释放
• 25-35诱导的[Ca²⁺]_i增加'>5.3.8 加兰他敏抑制Aβ_25-35诱导的[Ca²⁺]_i增加
• 5.3.9 加兰他敏对凋亡相关蛋白表达的影响
• 5.4 分析和讨论
• 第6章 总结与展望
• 6.1 研究工作总结
• 6.2 进一步工作展望
• 参考文献
• 攻读博士学位期间论文发表情况