黄酒麦曲浸提液的宏蛋白质组学研究

论文摘要

为全面了解黄酒麦曲浸提液中所有可溶性蛋白质（其中应主要包含原料小麦蛋白及各种微生物分泌的胞外酶蛋白）的情况,本论文首次借鉴新兴的宏蛋白质组学理论和思想,利用经典的双向电泳技术结合质谱分析、数据库检索对黄酒麦曲浸提液的宏蛋白质组进行了鉴定。特别指出,本研究中定义的“宏蛋白质组”指“黄酒麦曲浸提液中的所有可溶性蛋白”。通过对双向电泳条件（包括等电聚焦参数、上样量、IPG胶条长度等）的摸索和比较,确立了针对不同长度胶条的最佳等电聚焦程序和蛋白上样量（7 cm胶条最佳蛋白上样量为110μg左右,18 cm胶条最佳蛋白上样量为700μg左右）;通过比较利用不同pH值的浸提缓冲液制备样品对双向电泳结果的影响,同时结合黄酒发酵过程中实际的pH波动范围,确立了用于制备宏蛋白质组样品的浸提缓冲液pH值为pH4.2;通过对TCA-丙酮沉淀法、丙酮沉淀法、2-D Cleanup Kit试剂盒法三种不同样品制备方法效果的比较,确定以2-D Cleanup Kit试剂盒来制备宏蛋白质组进行不同麦曲样品的比较。最终建立了适用于黄酒麦曲浸提液宏蛋白质组的双向电泳技术体系。以浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司沈永和分厂的机制曲为研究对象,制备宏蛋白质组样品进行双向电泳实验,并对电泳图谱上所有肉眼可见的蛋白点（共145个）进行质谱分析及数据库检索鉴定,建立了绍兴黄酒麦曲浸提液宏蛋白质组的参考图谱。在鉴定成功的124个蛋白点中,有11个蛋白点来源于微生物（分别来源于4种真菌、2种细菌和1种放线菌）:其中包括葡萄糖-6-磷酸异构酶、羧肽酶前体蛋白、苹果酸脱氢酶、几丁质脱乙酰酶、铜/锌过氧化物歧化酶等5种酶蛋白和5种其他蛋白。另外113个非微生物来源的蛋白点中,主要来自麦曲原料小麦以及水稻、杂草等植物,种类包括酶抑制剂、水解酶、脱氢酶、歧化酶、异构酶、还原酶及其他蛋白等共44种。利用已建立的双向电泳技术,对不同麦曲浸提液的宏蛋白质组进行了差异分析:包括不同生产方式的机制曲和手工曲的比较、具有微地域差异的同一酒厂不同分厂的机制曲的比较、以及具有较大地域差异的不同省份酒厂机制曲的比较。利用双向电泳图谱分析软件分析,找到了它们之间的一些差异蛋白点,结合前述已建立的参考图谱对差异蛋白点的种类进行了初步推测。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 立题背景
• 1.2 麦曲在黄酒酿造中的作用
• 1.3 国内外研究进展
• 1.3.1 黄酒麦曲中微生物的研究现状
• 1.3.2 黄酒麦曲的酶学研究现状
• 1.3.3 传统酶学研究方法的局限性
• 1.3.4 宏蛋白质组学在黄酒麦曲研究中的应用
• 1.4 立题意义
• 1.5 研究内容及目标
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 麦曲
• 2.1.2 实验试剂
• 2.1.3 实验主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 麦曲浸提液宏蛋白质组样品制备
• 2.2.2 双向电泳实验分析
• 2.2.3 胶内酶解和质谱鉴定
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 黄酒麦曲浸提液宏蛋白质组双向电泳技术的建立
• 3.1.1 双向电泳条件的确立
• 3.1.2 浸提缓冲液pH 值对双向电泳结果的影响
• 3.1.3 宏蛋白质组样品不同制备方法的比较
• 3.1.4 小结
• 3.2 绍兴黄酒麦曲浸提液宏蛋白质组参考图谱的建立
• 3.3 不同麦曲浸提液宏蛋白质组的差异分析
• 3.3.1 机制曲与手工曲浸提液宏蛋白质组的差异分析
• 3.3.2 不同地域机制曲浸提液宏蛋白质组的差异分析
• 3.3.3 小结
• 第四章 结论与展望
• 4.1 主要结论
• 4.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文
• 附录：附表