“梨锈水病”病原菌的鉴定及分子生物学分析

论文摘要

梨锈水病是我国梨树上一种新的细菌性病害,最早在江苏徐淮地区发现,近年在浙江、山东、德州也有发生。该病发展迅速,为害性大,常引起植株枝干产生锈水状溃疡,叶片产生褐色斑点,最终整株枯死（王能友,2006）。本文以这种病害为研究对象,开展了梨锈水病病原菌鉴定及其基本生物学特性研究、特异性引物设计等工作,得到以下主要结果：1.对分离菌进行培养性状、过敏性试验、色素分泌观察和接种实验检测。结果显示,共有58个分离菌株,均无菌株存在色素分泌现象,36个菌株有烟草过敏性反应。将所有菌株在浙江的德清和鸬鸟地区梨树上进行接种后,以js4、js5、js6、js7为代表的30个分离菌株发病症状与自然发病症状完全一致,并且从接种病株上重新分离到了此病原细菌,此30个分离菌株经柯赫氏法则证明均为该病的病原菌。各菌株致病力无明显差异。2.对这些菌株进行了分子生物学鉴定。将上述30个病原菌株,通过分子检测等手段,扩增所分离菌株的16S、rDNA-ITS序列区和测序,通过Genbank数据库比对,结果显示,30个病原菌株与Dickeya chrysanthemi序列相似性分别为97%和96%,2个菌株与Erwinia pyrifoliae.序列相似性为99%。构建系统发育树显示,梨锈水病病原菌与Dickeya属其他种有一定的差异性,应为Dickeya属的一个新种。3.特异性引物的构建。通过扩增rDNA-ITS序列区和比对,设计出梨锈水病病原菌的特异性引物,经过特异性引物检测、灵敏度检测和实际样品检测验证等步骤,能够快速准确的将分离菌株同Dickeya chrysanthemi区分开来。曾有专家指出,我国发生的梨锈水病病原菌实为检疫对象梨火疫或者亚洲梨火疫病原（商明清,1992）；另外由于本病害已经被前人检测为Erwinia属（邱文等,2010）,但是具体为Erwinia属的哪一个种,一直以来均无相关报道（Hauben. L. et al.,1998）,至今尚无定论。针对以上两点质疑,我们对其进行进一步的鉴定分类,明确了梨锈水病的病原菌种类以及分类现状,同时在分子水平上构建了梨锈水病病原菌的检测方法,为今后开展梨锈水病的防治工作奠定一定的基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 上篇
• 第一章 梨树病害概述
• 1 梨树病害概述
• 1.1 梨树真菌病害
• 1.1.1 梨黑星病
• 1.1.2 梨轮纹病
• 1.1.3 梨锈病
• 1.1.4 梨黑斑
• 1.1.5 梨褐腐
• 1.1.6 梨树疫腐病
• 1.1.7 梨树干枯病
• 1.1.8 梨白粉病
• 1.1.9 梨树腐烂病
• 1.1.10 梨炭疽病
• 1.2 梨树病毒病害
• 1.2.1 梨石痘病
• 1.2.2 梨环纹花叶病
• 1.2.3 梨脉黄化病
• 1.3 梨树细菌病害
• 1.3.1 梨根癌病
• 1.3.2 梨火疫病
• 1.4 梨锈水病病害现状
• 1.4.1 危害症状
• 1.4.2 梨锈水病病原物
• 1.4.3 发病条件
• 2 Dickeya chrysanthemi的分类学地位
• 2.1 Dickeya chrysanthemi的分类学地位
• 2.2 Dickeya chrysanthemi的分类现状
• 2.3 Dickeya chrysanthemi的危害症状及特点
• 第二章 Dickeya chrysanthemi病原检测技术研究进展
• 1 传统检测技术
• 2 多聚酶链式反应技术及其他综合技术
• 2.1 多聚酶链式反应技术
• 2.2 其他综合性技术
• 下篇
• 第一章 梨锈水病病原菌分离鉴定
• 摘要
• ABSTRACT
• 1 实验材料
• 1.1 菌株与其他材料
• 1.2 主要试剂及仪器
• 1.3 基础培养基
• 2 方法
• 2.1 分离纯化方法
• 2.2 烟草过敏性试验
• 2.3 分离菌株色素分泌观察方法
• 2.4 分离菌株的接种方法
• 3 结果与分析
• 3.1 分离菌株的分离纯化
• 3.2 过敏性反应测定
• 3.3 分离菌株色素分泌观察
• 3.4 分离菌株接种实验
• 4 总结与讨论
• 第二章 梨锈水病病原菌分子生物学分析
• 摘要
• ABSTRACT
• 1 材料
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 基础培养基
• 1.3 试剂
• 1.4 引物
• 2 方法
• 2.1 特异性引物分析
• 2.1.1 特异性引物
• 2.1.2 PCR反应体系
• 2.1.3 PCR反应程序
• 2.2 16S-ITS rRNA序列测定
• 2.2.1 菌株基因组总DNA的提取
• 2.2.2 菌株16S-ITS DNA片段的扩增
• 2.2.3 16S-ITS DNA片段的回收
• 2.2.4 感受态细菌细胞的制备
• 2.2.5 PCR回收产物与载体的连接
• 2.2.6 热击转化
• 2.2.7 转化子阳性克隆和测序
• 2.3 病原菌基因序列系统发育树的构建
• 2.3.1 引物设计
• 2.3.2 PCR扩增
• 2.3.3 遗传分析
• 2.4 特异性引物的构建与检测
• 2.4.1 特异性引物设计
• 2.4.2 特异性引物检测
• 2.4.3 灵敏度检测
• 2.4.4 实际样品检测
• 3 结果与分析
• 3.1 特异性引物分析
• 3.1.1 梨火疫特异性引物分析
• 3.1.2 亚洲梨火疫特异性引物分析
• 3.2 16S-ITS rDNA序列测定
• 3.2.1 序列分析
• 3.3 系统发育树的构建
• 3.3.1 16S序列比对
• 3.3.2 ITS序列比对
• 3.4 特异性引物的构建
• 3.4.1 特异性引物设计
• 3.4.2 特异性引物检测
• 3.4.3 灵敏度检测
• 3.4.4 实际样品检测
• 总结与讨论
• 附录
• 参考文献
• 致谢