Glut-1反义寡核苷酸对人肝癌HepG2细胞Glut-1、MMP-2、MT-MMP表达及对HepG2细胞葡萄糖吸收的影响

论文摘要

研究背景：肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是最常见和最致命的恶性肿瘤之一,近年来无论是HCC的发病率,还是HCC的死亡率都在上升。上世纪九十年代以来,在我国肝癌已排位癌症死亡率的第二位。以根治性肝癌切除术为主的综合治疗或以肝移植术为主的综合治疗是目前临床上HCC的主要治疗方法,但只有少数HCC患者可获得及时的根治性肝癌切除术或肝移植术治疗,大多数HCC患者或者由于供肝短缺得不到及时的肝移植,或者因已处于病程的进展期或晚期,而无法得到手术治疗的机会,这些HCC患者的预后很差。而对于有机会获得根治性肝癌切除术或肝移植术治疗的肝癌患者,术后肿瘤的转移、复发依然严重制约着肝癌的临床治疗效果。肝癌的基因研究和基因治疗有望通过基因水平上的操作和介入来干预疾病的发生、发展和进程,从而达到治疗肝癌和预防肝癌术后复发、转移的目的。通过对肿瘤的能量供应进行有效的抑制来控制甚至消灭肿瘤是一个十分吸引人的思路。有研究表明：（1）：葡萄糖转运蛋白-1（glucose transporter-1, Glut-1）是癌细胞的葡萄糖转运和代谢的关键限速因子,肿瘤细胞在乏氧环境中通过Glut-1的高表达来提高能量供应,使肿瘤得以生存和生长,所以Glut-1与肿瘤的发生、生存和发展密切相关。（2）：基质金属蛋白酶2（Matrix Metalloproteinase-2,MMP-2）、膜型基质金属蛋白酶（Membrane Type-MMP,MT-MMP）与肿瘤的侵袭、转移密切相关,它们可以通过降解细胞外基质、调节细胞间黏附以及促进新血管的形成来影响恶性肿瘤的侵袭与转移。目前,对于Glut-1反义寡核苷酸是否能通过抑制HCC细胞的Glut-1表达、进而抑制MMP-2、MT-MMP表达及细胞对葡萄糖的吸收,以至预防或抑制HCC的发生、发展、转移及复发,国内外尚无类似报道。研究目的：本课题拟研究Glut-1反寡义核苷酸对人肝癌HepG2细胞Glut-1,MMP-2、MT-MMP表达的抑制作用及其对HepG2细胞的葡萄糖吸收的影响,以探讨Glut-1作为原发性肝细胞肝癌治疗靶点的可能性。研究方法：按实验设计要求将HepG2细胞分为4组：未转染细胞对照组,GLUT-1pcDNA3.1组,反义GLUT-1pcDNA3.1组,pcDNA3.1空载体对照组。用双酶切法构建pcDNA3.1（+）-Glut-1和pcDNA3.1（+）-反义Glut-1;常规进行HepG2细胞培养制备实验用的细胞；使用Lipofectamine 2000试剂将空pcDNA3.1 pcDNA3.1-anti-Glut（+）, pcDNA3.1-Glut（+）载体转染进入HepG-2细胞；按厂家方案,对以上三组及另一组未转染的HepG2细胞按分组要求进行细胞培养、转染、扩增,达到要求后将各组细胞冻存,各取部分细胞进行有关检测：1.PCR鉴定转染成功;2RT-PCR检测Glut-1、MMP-2、MT-MMP的表达水平;3Western blotting检测Glut-1蛋白的表达水平；4.各组用葡萄糖刺激1小时后,分别收集培养上清,检测细胞培养上清中的葡萄糖浓度。实验数据采用mean±standard deviation （M±SD）来表示,使用软件SPSS （Version 16.0）进行统计学分析,采用独立样本的T检验来确定P值。P<0.05有统计学上的意义。研究结果：检测结果显示：1.质粒GLUT-1pcDNA3.1和反义质粒GLUT-1pcDNA3.1均已按要求成功转染进入相关实验组细胞中；2.与未转染细胞对照组GLUT-1pcDNA3.1组比较,反义GLUT-1pcDNA3.1组的Glut-1 mRNA表达明显下调（P<0.05）,而与pcDNA3.1空载体对照组比较则无下降；3.反义GLUT-1pcDNA3.1组的MMP-2 mRNA、MT-MMP mRNA的表达低于未转染细胞对照组、GLUT-1pcDNA3.1组和pcDNA3.1空载体对照组；4.与未转染细胞对照组、GLUT-1pcDNA3.1组和pcDNA3.1空载体对照组比较,反义GLUT-1pcDNA3.1组的Glut-1蛋白表达下降；5.反义GLUT-1pcDNA3.1组的葡萄糖吸收低于GLUT-1pcDNA3.1组和pcDNA3.1空载体对照组,但高于未转染细胞对照组。研究结论：（1）Glut-1反义寡核苷酸可下调入肝癌HepG2细胞的Glut-1表达、降低Glut-1蛋白生成水平,并抑制HepG2细胞对葡萄糖的吸收,提示以Glut-1作为治疗靶点,通过抑制HCC细胞的Glut-1mRNA表达、Glut-1蛋白生成和HCC细胞对葡萄糖的吸收,有望降低或者阻断HCC的能量供应,达到抑制HCC肿瘤的发生和发展的治疗目的。（2）:Glut-1反义寡核苷酸可下调人肝癌HepG2细胞的MMP-2mRNA和MT-MMPmRNA表达水平,提示以Glut-1作为治疗靶点,有可能可以通过抑制HCC细胞的MMP-2mRNA和MT-MMPmRNA表达,降低甚至阻断HCC细胞的降解细胞外基质、调节细胞间黏附以及促进新血管的形成的能力,从而降低HCC的侵袭潜能,预防和（或）减少HCC的转移和复发。（3）:Glut-1反义寡核苷酸下调人肝癌HepG2细胞MMP-2mRNA和MT-MMPmRNA表达的机制及Glut-1与MMP-2、MT-MMP的关系有待进一步研究明确。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 英文缩写词表
• 引言
• 一 材料与方法
• 1 材料
• 2 方法
• 二 结果
• 1 质粒转染的结果
• 2 GLUT-1AS-ODN对HEPG-2细胞GLUT-1 MRNA、MMP-2MRNA、MT-MMPMRNA表达的作用
• 3 GLUT-1AS-ODN对HEPG-2细胞GLUT-1蛋白表达的影响
• 4 GLUT-1AS-ODN对HEPG-2细胞葡萄糖吸收的影响
• 三 讨论
• 四 结论
• 参考文献
• 文献综述一
• 参考文献
• 文献综述二
• 参考文献
• 附录一 作者简历
• 附录二 发表论文