马勃化学成分的分离、鉴别及对组织蛋白酶L抑制作用研究

论文摘要

本论文的主要工作是对马勃的化学成分进行分离和鉴定及对其组织蛋白酶L抑制作用进行研究。马勃是真菌类中药,具有止血、抗菌、抗癌和抗炎止咳等功效。Cathepsin L是一类嗜酸性的蛋白酶,Cathepsin L的表达和活性受到严格的调控,如果其表达出现异常,将导致一系列疾病包括癌症和心血管病等的发生为了对这些疾病进行防治,就必须抑制Cathepsin L的活性。研究表明,马勃对Cathepsin L具有良好抑制作用,意味着马勃含的某些活性组分,有可能成为下一代的抗癌等疾病的药物。如果能够鉴别出这种活性组分,将产生重大的社会和经济效益,造福于社会。鉴于这种情况,本文进行了马勃化学成分的分离和鉴别,并将分离出的组分进行Cathepsin L抑制作用研究。采用分析型HPLC优化分离条件,常规制备型HPLC进行重复制备和二维Sepbox制备色谱进行高通量制备得到活性组分,并将分离出来的组分进行活性测试。实验结果表明：二维Sepbox高通量制备方案优于常规制备HPLC分离制备方案。应用LC-IT-TOFMS对得到的一个活性较高组分进行分析和结构鉴定,结果表明,此组分含有5种化合物,并推断出一种化合物的结构,命名为1,2-二氢-2-羟基-5,10-二氧苯并喹啉-9-羧酸。对其进行分子对接技术研究,与文献报道的活性位点一致,此方法为新药研发提供了新的研究思路。将不同前处理方法（顶空、超临界CO2、不同溶剂超声）得到的马勃提取物进行Cathepsin L活性测试,并应用GC-MS对其化学成分进行研究,对各种前处理方法所得化合物的相对含量进行了分析。总共鉴别得到62种化合物,其中,HS-SPME-GCMS得到19种化合物,主要为烷烃类和吗啉衍生物；SFE-CO2鉴别得到24种化合物,此方法得到的酰胺类化合物种类和含量极高；不同溶剂超声萃取得到17～26种化合物,得到的化合物类型与所用溶剂有关。产自内蒙和吉林的马勃对Cathepsin L（?）抑制效果不同,采用扫描电镜（SEM）、傅立叶变换红外光谱（FTIR）和裂解气质联用（Py-GCMS）从微观组成、主要类别及化学成分方面研究其差异之处。总之,本文采用了HPLC, GC-MS等方法对马勃的化学组分进行了分离分析,并对活性成分进行了鉴定。对不同产地马勃及不同前处理方法得到的马勃提取物分别进行了Cathepsin L抑制效果测试,本文结论为马勃化学成分的进一步研究提供了参考,并为将来马勃化学组分研究打下基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 前言
• 1.2 马勃本草考证与植物形态
• 1.3 马勃药理作用研究
• 1.3.1 止血
• 1.3.2 抗菌
• 1.3.3 抗癌
• 1.3.4 抗炎止咳
• 1.4 马勃化学成分研究
• 1.4.1 氨基酸类
• 1.4.2 甾体化合物
• 1.4.3 萜类化合物
• 1.4.4 马勃多糖
• 1.4.5 蛋白质和多肽
• 1.4.6 其它成分
• 1.5 分离和鉴别方法
• 1.5.1 分析型HPLC在中药中的应用
• 1.5.2 制备型HPLC在中药中的应用
• 1.5.3 维制备型HPLC在中药中的应用
• 1.5.4 GC-MS在中药鉴别中的作用
• 1.6 组织蛋白酶L
• 1.6.1 组织蛋白酶的结构
• 1.6.2 组织蛋白酶L的结构
• 1.6.3 组织蛋白酶L与病理过程的关系
• 1.7 组织蛋白酶L抑制剂
• 1.7.1 内源性蛋白抑制剂
• 1.7.2 合成肽类抑制剂
• 1.8 本课题的目的、意义及创新之处
• 1.8.1 本课题的目的和意义
• 1.8.2 本课题的研究内容
• 1.8.3 本课题的创新之处
• 第2章 马勃生物活性组分的分离
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 实验仪器与试剂
• 2.2.2 马勃少量提取及前处理
• 2.2.3 Cathepsin L生物活性测试
• 2.2.4 马勃的大量提取及前处理
• 2.2.5 分析型HPLC条件优化
• 2.2.6 常规制备型HPLC分离制备方案
• 2.2.7 Sepbox-2D 250型全自动二维制备HPLC分离制备方案
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 马勃醇提物生物活性测试结果
• 50测试'>2.3.2 高活性的乙酸乙酯萃取液IC₅₀测试
• 2.3.3 分析型HPLC条件优化结果
• 2.3.4 常规制备型HPLC分离结果
• 2.3.5 常规制备HPLC生物活性测试结果
• 2.3.6 Sepbox-2D 250型制备HPLC分离结果
• 2.3.7 Sepbox-2D 250型制备HPLC生物活性测试结果
• 2.4 本章小结
• 第3章 马勃生物活性组分的结构鉴定
• 3.1 引言
• 3.2 实验仪器试剂与实验原理
• 3.3 实验部分
• 3.4 分析条件
• 3.4.1 液相色谱条件
• 3.4.2 MS检测条件
• 3.5 活性组分结构分析
• 3.6 分子对接技术
• 3.7 本章小结
• 第4章 应用气质联用研究鉴别马勃的化学成分
• 4.1 引言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 仪器试剂
• 4.2.2 顶空固相微萃取（HS-SPME）
• 2萃取'>4.2.3 超临界CO₂萃取
• 4.2.4 溶剂超声萃取
• 4.2.5 组织蛋白酶L实验
• 4.3 GC-MS实验条件
• 4.3.1 顶空固相微萃取气质条件
• 4.3.2 其余样品气质条件
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 马勃提取物的Cathepsin L抑制效果
• 4.4.2 马勃提取物的化学成分分析
• 4.5 本章小结
• 第5章 内蒙和吉林马勃对Cathepsin L抑制作用研究及产地对比分析
• 5.1 引言
• 5.2 实验部分
• 5.2.1 仪器试剂
• 5.2.2 马勃少量提取及Cathepsin L实验
• 5.2.3 扫描电镜（SEM）
• 5.2.4 红外光谱测试（FTIR）
• 5.2.5 裂解气质（Py-GCMS）
• 5.3 结果
• 5.3.1 不同产地马勃的Cathepsin L抑制效果
• 5.3.2 SEM观察结果
• 5.3.3 红外光谱测试结果
• 5.3.4 裂解气质实验结果
• 5.4 本章小结
• 第6章 结论与展望
• 参考文献
• 致谢
• 在学期间发表的学术论文及研究成果