杆状病毒在转P35基因昆虫细胞系中连续传代的研究

论文摘要

昆虫细胞作为重组病毒的受体能成功高效地表达外源基因,生产具有重要医用价值、具备天然活性的生物工程制品,从而使昆虫细胞培养倍受青睐。目前,可以通过转基因的方法改良现有细胞,从而获得高产昆虫杆状病毒和外源蛋白的昆虫细胞系。 本研究是将粘虫的胚胎细胞系NEAU-Ms-7311和转P35基因细胞系TMsF分别接种昆虫病毒MsNPV和AcNPV,发现AcNPV对两种细胞的感染速度较快,感染率较高,尤其是对TMsF,最高感染率可达74%。 用96孔板对转基因细胞进行克隆,共得到转基因细胞克隆株15株。通过细胞传代,选出生长且状况良好的克隆株共有11株,命名为CT-1、CT-2…CT-11.11株细胞系分别经PBS处理和多角体产量比较筛选出2个细胞克隆株:CT-7和CT-8.接种毒原AcNPV进行离体传代10代,发现AcNPV对对照细胞TMsF和克隆细胞株CT-8的感染率和OB产量都有明显下降趋势,而克隆细胞株CT-7的变化趋势稳定。 CT-7细胞形态主要为纺锤形和圆形,贴壁生长。增殖很快,群体倍增时间为37.1小时,最大生长密度可达9×105cells/ml.对AcNPV病毒感染率达80.5%,多角体产量最高为66.4 OBs/cell,是一株高产杆状病毒的细胞系。 对离体传代毒原AcNPV的TCID50/ml测定发现,两种细胞中,AcNPV同时在第三代时滴度达到最大,CT-7细胞第三代时的病毒滴毒值为3×108TCID50/ml远远高于对照TMsF细胞,并且滴度曲线比较平直没有明显的下降趋势。然而TMsF细胞的滴度曲线下降趋势变化明显,由2.7×107TCID50/ml下降到1.4×106TCID50/ml。 CT-7细胞株有较强的营养抗逆性,细胞在无营养的PBS盐缓冲液中1天以后,CT-7细胞有86%存活,比野生型Tn581-4细胞高出36%,第3天时,TMsF细胞全部死亡,CT-7细胞到第5天仍然有6%存活细胞。 在CT-7细胞中离体复制的不同代数的AcNPV病毒,对甜菜夜蛾幼虫的毒力相差不大,甜菜夜蛾的校正死亡率为47%～63%,即多次传代对离体传代产生的病毒多角体毒力影响不大。但在对照组TMsF细胞中复制的多角体随传代次数的增加杀虫活性出现明显下降现象。 昆虫病毒AcNPV在CT-7细胞中离体传代10次,病毒未出现传代效应,其病毒滴度、多角体形态及产量、杀虫毒力均无明显变化。CT-7细胞是昆虫杆状病毒离体复制的优良细胞系。

论文目录

• 1 引言
• 1.1 杆状病毒侵染机制
• 1.2 杆状病毒表达载体
• 1.2.1 线性化
• 1.2.2 大肠杆菌-昆虫细胞穿梭载体（Bac to Bac系统）
• 1.2.3 酵母-昆虫细胞穿梭载体
• 1.2.4 tk基因
• 1.2.5 体外Cre酶促定位
• 1.2.6 Neo基因
• 1.3 昆虫细胞培养及其应用
• 1.3.1 昆虫细胞系
• 1.3.2 细胞株
• 1.3.3 培养基
• 1.3.4 昆虫细胞培养的应用
• 1.4 抗细胞调亡基因P35的研究
• 1.5 立题的依据及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 昆虫细胞系
• 2.1.2 昆虫细胞培养基
• 2.1.3 供试昆虫与病毒
• 2.1.4 仪器设备
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 培养基的配制
• 2.2.2 细胞传代培养的方法
• 2.2.3 细胞冻存与复苏的方法
• 2.2.4 MsNPV毒原的制备
• 2.2.5 AcNPV毒原的活化
• 2.2.6 病毒敏感性测定
• 50／ml）的测定'>2.2.7 活化AcNPV毒原的50％组织培养感染剂量（TCID₅0／ml）的测定
• 2.2.8 细胞的克隆及敏感性细胞株的筛选
• 2.2.9 毒原的离体传代
• 2.2.10 营养抗性（抗PBS）测定
• 2.2.11 细胞生长曲线的测定
• 3 结果与分析
• 3.1 细胞冻存方法的选择
• 3.2 毒原的制备
• 3.3 病毒敏感性的测定
• 3.4 转基因细胞克隆株的获得
• 3.5 转基因细胞克隆株的筛选
• 3.5.1 转基因细胞的传代
• 3.5.2 转基因细胞的感染率、OB产量和抗PBS筛选
• 3.6 活化的AcNPV毒原的TCID50测定
• 3.7 病毒离体传代过程中敏感性及OB产量比较
• 3.8 细胞株CT-7生物学测定
• 3.8.1 细胞形态观察
• 3.8.2 细胞生长曲线测定
• 3.8.3 毒原的离体传代
• 4 讨论
• 4.1 细胞的冻存与复苏
• 4.2 转基因原始细胞的选取
• 4.3 转基因细胞的构建和克隆
• 4.4 病毒在细胞克隆株CT-7中传代培养
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 在读期间发表的学术论文
• 作者简介
• 致谢