芜菁花叶病毒与烟草脉带花叶病毒全基因组序列测定及分析

论文摘要

芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus,TuMV）、烟草脉带花叶病毒（Tobacco vein banding mosaic virus,TVBMV）和甜菜花叶病毒（Beet mosaic virus,BtMV）均为世界性分布的病毒,分别是危害十字花科蔬菜、茄科作物和藜科植物的主要病毒。本研究克隆了2个TuMV分离物和1个TVBMV分离物的全基因组序列,分析了这2种马铃薯Y病毒属病毒的分子变异情况,并首次报道了BtMV能自然侵染莴苣。芜菁花叶病毒（TuMV）:从山东泰安和潍坊的萝卜上分离得到2个TuMV分离物WFLB06和TANX2,测定了它们的全基因组序列。生物学实验表明2个TuMV分离物均属于BR致病型,能同时侵染芸薹属和萝卜属植物,系统进化树分析表明它们均属于basal-BR组,这是中国basal-BR组分离物全基因组序列的首次报道。通过RDP重组软件进行分析,发现这2个TuMV分离物均存在多次重组。其中WFLB06分离物是发生在P1基因、NIb基因和CI基因上的basal-BR与Asian-BR谱系间的重组,TANX2分离物是发生在P1基因、6K2基因、VPg基因上的basal-BR谱系内的重组。而且,这2种重组类型均是与先前报道的37种类型不同的新的重组类型。核苷酸及氨基酸的一致率比较发现,中国和日本分离物来源于相同的种群,中国的TuMV basal-BR组的分离物可能来源于日本。分析中国TuMV分离物的遗传多样性,发现中国TuMV分离物的编码区在进化过程中氨基酸非常保守,处于负向或纯化选择。烟草脉带花叶病毒（TVBMV）:本研究获得了我国烟草脉带花叶病毒主流株系代表分离物HN39的全基因组序列,HN39的全基因组序列为9570个核苷酸,这是世界上获得的TVBMV的第二个全基因组序列。TVBMV-HN39全基因组序列与水茄花叶病毒（Wild tomato mosaic virus,WTMV）一致率最高,基因组的不同区段与不同马铃薯Y病毒属病毒的相应区段有最高的序列一致率,说明TVBMV-HN39的不同基因可能由不同的祖先进化而来。甜菜花叶病毒（BtMV）:从泰安郊区菜田中表现花叶、矮化的莴苣病株上得到病毒分离物SD,血清学检测结果表明SD分离物是马铃薯Y病毒属病毒。利用马铃薯Y病毒属病毒的简并引物,通过RT-PCR技术获得了其3′-端约1.7 kb片段。Blast分析证明该分离物为BtMV。Western blotting结果进一步证实了这一结论。BtMV-SD与其它BtMV分离物3′-端基因序列的一致率为91.1-98.8%。这是BtMV在自然条件下侵染莴苣的首次报道。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1. 马铃薯Y 病毒属病毒的生物学特性
• 1.1 马铃薯Y 病毒属病毒的形态特性
• 1.2 寄主范围
• 1.3 病毒的传播
• 1.4 细胞病理
• 2. 马铃薯Y 病毒属病毒的分子生物学特性
• 2.1 病毒基因组的结构
• 2.2 病毒基因的功能
• 2.2.1 5′-非翻译区（5′-UTR）
• 2.2.2 3′-非翻译区（3′-UTR）
• 2.2.3 P1 蛋白
• 2.2.4 HC-Pro 蛋白
• 2.2.5 P3 蛋白
• 2.2.6 6K1 蛋白
• 2.2.7 CI 蛋白
• 2.2.8 6K2 蛋白
• 2.2.9 NIa-Pro 和NIa-VPg 蛋白
• 2.2.10 NIb 蛋白
• 2.2.11 CP 蛋白
• 3. 马铃薯Y 病毒属病毒的分类
• 4. 马铃薯Y 病毒属病毒全基因组序列的研究
• 5. 本研究的目的和意义
• 第二章 两个芜菁花叶病毒中国分离物的全基因组序列测定及分析
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 病毒样品的采集
• 1.1.2 菌株和载体
• 1.1.3 生化及分子生物学试剂
• 1.1.4 引物合成
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 生物学测定
• 1.2.2 植物总RNA 的提取
• 1.2.3 引物设计
• 1.2.4 反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和5'-RACE 扩增
• 1.2.5 PCR 产物回收
• 1.2.6 连接反应
• 1.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 1.2.8 连接产物转化大肠杆菌
• 1.2.9 改良碱裂解法提取质粒DNA
• 1.2.10 重组质粒鉴定
• 1.2.11 序列测定与分析
• 2. 结果与分析
• 2.1 生物学特性
• 2.2 TuMV 分离物的 RT-PCR 结果
• 2.3 重组质粒的电泳鉴定及PCR 鉴定
• 2.4 TuMV 分离物的核苷酸与氨基酸序列分析
• 2.5 与其它TuMV 分离物序列一致率分析比较
• 2.6 TuMV 分离物的分子变异
• 2.6.1 系统进化树分析
• 2.6.2 重组分析
• 2.6.3 中国TuMV 分离物变异分析
• 3. 结论与讨论
• 第三章 烟草脉带花叶病毒 HN39 分离物全基因组序列测定及分析
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 病毒样品的采集和分离纯化
• 1.1.2 菌株和载体
• 1.1.3 生化及分子生物学试剂
• 1.1.4 引物合成
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 生物学测定
• 1.2.2 植物总RNA 的提取
• 1.2.3 引物设计
• 1.2.4 反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和5'-RACE 扩增
• 1.2.5 PCR 产物回收
• 1.2.6 连接反应
• 1.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 1.2.8 连接产物转化大肠杆菌
• 1.2.9 改良碱裂解法提取质粒DNA
• 1.2.10 重组质粒鉴定
• 1.2.11 序列测定与分析
• 2. 结果与分析
• 2.1 生物学测定
• 2.2 TVBMV 分离物的 RT-PCR 结果
• 2.3 重组质粒的电泳鉴定及PCR 鉴定
• 2.4 序列分析
• 2.5 与TVBMV-YND 分离物序列比较
• 2.6 TVBMV-HN39 与其它potyviruses 的关系
• 3. 结论与讨论
• 第四章 甜菜花叶病毒莴苣分离物3'-末端基因的克隆及序列分析
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 病毒样品的采集和分离纯化
• 1.1.2 菌株和载体
• 1.1.3 生化及分子生物学试剂
• 1.1.4 引物合成
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 SDS-琼脂免疫双扩散试验
• 1.2.2 植物总RNA 的提取
• 1.2.3 引物设计
• 1.2.4 反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）
• 1.2.5 PCR 产物回收
• 1.2.6 连接反应
• 1.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 1.2.8 连接产物转化大肠杆菌
• 1.2.9 改良碱裂解法提取质粒DNA
• 1.2.10 重组质粒鉴定
• 1.2.11 序列测定与分析
• 1.2.12 Western blotting 分析
• 2. 结果与分析
• 2.1 病株田间症状
• 2.2 血清学鉴定
• 2.3 基因的扩增及克隆
• 2.4 序列测定与分析
• 2.5 Western blotting 分析
• 3. 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表论文情况
• 附彩图