论文摘要
目的:构建表达人类免疫缺陷病毒1型（human immunodeficiency virus type 1, HIV-1）反式激活蛋白（transactivative transcription protein, Tat）的慢病毒载体,探讨其对人雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞体外增殖和迁移的影响。方法: （1）根据GenBank登记的Tat101基因序列设计PCR引物,分别在上下游引物的5’端引入Nhe I和Bam HI限制性酶切位点。同时,在下游引物的5’端引入Flag基因序列。以携带Tat101的质粒为模板,扩增Tat基因,经酶切、纯化后克隆入慢病毒包装系统的转移质粒pHAGE-CMV-MCS-IZsGreen,克隆经PCR、酶切鉴定及测序成功后,命名为pHAGE-Tat,并大量扩增。扩增后的pHAGE-Tat同慢病毒包装系统的包膜质粒pMD2.G和包装质粒psPAX2共转染293T包装细胞,包装出携带HIV-1 Tat基因的慢病毒载体,用有限稀释法检测病毒滴度。取慢病毒感染293T细胞和人前列腺癌PC-3细胞,通过RT-PCR和Western blot检测RNA和蛋白水平的表达。（2）实验设感染组、空载体组、未感染组及对照组,慢病毒感染后不同时间点,用MTT法观察Tat对人前列腺癌PC-3细胞增殖的影响,并绘制细胞生长曲线。用流式细胞仪分析细胞周期的变化。通过细胞划痕实验观察Tat对人前列腺癌PC-3细胞迁移的影响。结果:成功构建了能表达HIV-1 Tat的慢病毒载体LV-Tat,病毒滴度为5.73×106 ifu/ml。慢病毒感染293T细胞和人前列腺癌PC-3细胞后分别于48和24h可测得Tat蛋白的表达。MTT试验显示,慢病毒液感染24,48,72,96和120h,感染组细胞平均增殖率为126.86±10.41%,未感染组和空载体组细胞平均增殖率分别为100.00±0.00%和99.35±5.05%,两组无统计学差异（P>0.05）。感染组与未感染组或空载体组相比均有统计学差异（P<0.05）。流式细胞仪分析细胞周期结果发现,慢病毒感染48h,感染组细胞S期占28.71±1.16%,未感染组和空载体组细胞各占17.19±0.99%和18.50±1.07%,感染组与未感染组或空载体组比较均有统计学差异（P<0.05）。Tat可以使处于S期的人前列腺癌PC-3细胞比例增加。划痕试验显示,用MMC抑制细胞周期后,感染24h,感染组细胞迁移率为34.70±5.62%。空载体组和未感染组细胞迁移率分别为37.40±4.90%和34.27±3.40%。感染组与空载体组（P>0.05）或未感染组（P>0.05）相比均无统计学差异。细胞生长周期被抑制后,Tat对人前列腺癌PC-3细胞的迁移无明显影响。结论: （1）表达HIV-1 Tat的慢病毒载体LV-Tat构建成功,且能够在人前列腺癌PC-3细胞中表达。（2）慢病毒载体介导的HIV-1 Tat有促进人前列腺癌PC-3细胞增殖的作用,而对人前列腺癌PC-3细胞的迁移无明显影响。
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