莱茵衣藻人工微RNA表达载体的构建及FAT1和DLD2基因功能的解析

论文摘要

莱茵衣藻是一种单细胞真核绿藻,近年来,其分子遗传学的研究取得了大量创新性的研究成果,且转化系统已经成熟,是一个受到广泛重视的进行遗传研究的模式生物。人工微RNA技术具有特异性高、效率高等优点,是植物中进行基因功能研究的良好工具。本研究采用人工微RNA技术,以衣藻内源的miRNA为骨架,设计衣藻人工微RNA,旨在利用人工微RNA技术,对莱茵衣藻FAT1和DLD2基因功能进行解析,探寻其编码的产物是否为脂合成过程中的关键酶。传统的amiRNA表达载体构建方法费用高、操作繁琐,本研究中采用的基于一步法反扩和接合辅助的遗传整合克隆（mating-assisted genetically integrated cloning, MAGIC）的amiRNA表达载体构建方法具有高效、操作简单、成本低、高通量等优点。主要研究结果如下：（1）构建了用于产生amiRNA表达单元的供体骨架载体pRTK-gfp和用于将amiRNA表达单元整合到衣藻基因组的受体骨架载体pmiR1162-gfp;（2）采用基于一步法反扩和MAGIC的amiRNA表达载体构建方法构建了特异性针对FAT1和DLD2基因的amiRNA表达载体pmiR1162-FAT1和pmiR1162-DLD2;（3）通过玻璃珠法分别将amiRNA表达载体pmiR1162-FAT1和pmiR1162-DLD2转化莱茵衣藻CC-425细胞,PCR验证转基因衣藻的阳性克隆率为85%；（4）荧光定量PCR检测结果显示转基因衣藻中FAT1和DLD2基因的相对转录水平降低了60-85%；（5） Nile red染色法结果显示FAT1基因的沉默对衣藻中中性脂含量降低的效果比较明显,而DLD2基因的沉默对衣藻中性脂含量影响不大。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 第一部分 文献综述
• 1.1 莱茵衣藻是一种重要的实验室模式生物
• 1.1.1 莱茵衣藻简介
• 1.1.2 莱茵衣藻作为模式生物
• 1.1.3 莱茵衣藻遗传转化方法的研究
• 1.2 功能基因组学研究概况
• 1.2.1 生物信息学
• 1.2.2 功能基因组学研究主要方法
• 1.3 MicroRNA研究概述
• 1.3.1 microRNA与siRNA的区别
• 1.3.2 miRNA的发现过程
• 1.3.3 microRNA的成熟及效应过程
• 1.3.4 真核生物miRNA的应用
• 1.3.5 人工微RNA（artificial microRNA,amiRNA）技术
• 1.4 本研究中选择的基因
• 1.5 本研究的目的意义
• 第二部分 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 主要试剂和酶
• 2.1.4 主要缓冲液
• 2.1.5 仪器和设备
• 2.1.6 本实验中用到的引物
• 2.2 方法
• 2.2.1 质粒DNA的抽提及纯化
• 2.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.3 大肠杆菌的常规转化
• 2.2.4 PCR反应体系
• 2.2.5 接合转移（MAGIC）构建amiRNA表达载体的过程
• 2.2.6 莱茵衣藻CC-425的玻璃珠转化
• 2.2.7 荧光定量PCR检测
• 2.2.8 Nile red染色法检测衣藻中中性脂含量
• 第三部分 结果与分析
• 3.1 高通量的衣藻amiRNA表达载体构建技术
• 3.1.1 供体质粒pRTK-gfp的构建
• 3.1.2 受体质粒pmiR1162-gfp的构建
• 3.1.3 amiRNA表达载体的构建
• 3.2 转基因衣藻的获得
• 3.3 荧光定量PCR检测目的基因的RNA表达水平
• 3.4 Nile red染色法定量测定中性脂含量
• 第四部分 讨论与展望
• 4.1 讨论
• 4.1.1 本研究中的克隆方式
• 4.1.2 FAT1和DLD2基因的沉默对衣藻中性脂积累影响的讨论
• 4.2 小结
• 4.3 展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢