鲫鱼PKR-like（PKZ）Zα能将含GC片段的B-DNA翻转为Z-DNA

论文摘要

PKZ是一个eIF2α激酶家族新成员,它的C-端为eIF2α激酶催化结构域,N-端为Z-DNA结合域（Zα）。Zα由2个亚结构域组成,分别为Zα1和Za2,其功能尚不清楚。为了研究Za的功能,包括Za的结合翻转DNA的偏好性及寡聚DNA长度与形成Z-DNA的关系,以及Za中一些重要氨基酸位点对翻转的贡献和影响。我们首先合成了Oligo DNA。同时表达Za及其9个点突变体和2个置换型多肽。我们用圆二色谱研究了鲫鱼Zα与寡聚DNA的相互作用,发现（1）发夹片段长度太短不利于形成Z-型构象。（2）与Zα1Zα2有明显反应的发夹为Hairpin4。（3）Zα1Zα2与含有GC片段的Oligo DNA有明显相互作用,而不能与含有TA片段的DNA反应。另外,Zα1Zα2也很难和Primer反应。（4）Zα1Zα1可将Hairpin6翻转成Z-DNA,而替换型Zα2Zα2几乎丧失了翻转活性。另外,我们还考察了9个氨基酸位点对于翻转功能的重要性,发现N38A、Y42A、P57A和P58A位点突变为丙氨酸时,蛋白质几乎失去翻转功能,说明这些位点应该直接参与了多肽-DNA相互作用及后续的翻转。而S35A和K56A位点突变为丙氨酸仍保有部分翻转活性,表明这2个位点对多肽-DNA相互作用及翻转成Z-型DNA贡献不大或者不那么重要。此外我们还有意外一个的发现：用K34A、R39A、W60A滴定Hairpin 6的光谱与野生型迥然不同,这可能预示翻转的方向与野生型的相反,W60A为什么具有这种有趣的情况有待后续实验的进一步研究。

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ABSTRACT

第1章文献综述

1.1 Zα结构域

1.1.1 ADAR1

1.1.2 DLM-1（ZBP1）

1.1.3 E3L

1.1.4 PKZ

1.2 左手螺旋DNA（Z-DNA）

1.2.1 Z-DNA的发现命名

1.2.2 Z-DNA的形成条件

1.2.3 Z-DNA的功能

1.3 与Zα、Z-DNA相关的研究方法

1.3.1 扫描隧道显微技术（Scanning Tunnelling Microscopy,STM）

1.3.2 酵母单杂交体系（yeast one-hybrid system）

1.3.3 圆二色谱（Circular Dichroism,CD）

1.3.4 表面等离子共振光谱（surface plasmon resonance,SPR）

1.3.5 荧光光谱

1.4 鲫鱼PKZ（CaPKR-like）Zα研究现状、目的和意义

第2章材料和方法

2.1 主要仪器设备

2.2 主要试剂、试剂盒

2.3 缓冲配方

2.3.1 镍柱缓冲液体系

2.3.2 透析缓冲液

2.3.3 Oligo DNA溶解及稀释缓冲液

2.3.4 寻求合适的实验条件

2.3.5 高盐溶液

2.4 载体和菌株

2.5 构建

2.6 蛋白的诱导表达及纯化

2.7 Bradford法定量蛋白

2.7.1 蛋白质标准曲线的测定

2.7.2 样品的测定

2.7.3 数据处理

2.8 Oligo DNA

2.9 Oligo DNA的圆二色光谱

2.9.1 高盐下的Hairpin6与Hairpin3 Oligo DNA

2.9.2 各种多肽与oligo DNA相互作用

2.10 蛋白的圆二色光谱及荧光光谱

第3章实验结果

3.1 蛋白纯化结果

3.2 蛋白定量结果

3.2.1 标准曲线的绘制

3.2.2 12个表达多肽定量结果

3.2.3 以蛋白浓度确定每一步滴加量

3.2.4 表达多肽圆二色光谱、天然荧光、ANS荧光的测定

3.3 Oligo DNA滴定与单独圆二色光谱

3.3.1 Hairpin 6在4.5 mol/L NaCl高盐浓度条件下能够形成Z-DNA

3.3.2 表达多肽翻转Hairpin 6最佳NaCl浓度的确定

3.3.3 PKZ Zα滴定不同长度Hairpin DNA的CD谱

3.3.4 点突变Zα多肽对Hairpin 6构象的影响

3.3.5 Zα对含有GC或TA重复片段Oligo DNA构象的影响

3.3.6 Zα对非GC重复DNA构象的影响

3.3.7 替换型Zα1Zα1对Hairpin系列构象的影响

3.4 10个表达多肽的光谱性质

3.4.1 10个表达多肽的圆二色光谱

3.4.2 10个表达多肽天然荧光

3.4.3 10个表达多肽ANS荧光

第4章分析与讨论

4.1 实验结果的分析与讨论

4.1.1 发夹DNA形成Z-DNA能力的分析

4.1.2 盐浓度影响Zα与Hairpin 6滴定效果

4.1.3 各个突变体蛋白影响Hairpin 6的构象

4.1.4 Zα翻转GC、TA和非GC重复DNA片段

4.2 PKZ整体功能的设想

4.2.1 翻转酶flippase

4.2.2 胞质抑制翻译模型

参考文献

致谢

攻读学位期间的研究成果

鲫鱼PKR-like（PKZ）Zα能将含GC片段的B-DNA翻转为Z-DNA

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