快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒免疫胶体金诊断试纸条的研制

论文摘要

猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）属于动脉炎病毒科（Arteriviridae）,动脉炎病毒属（Arterivirus）,可引起怀孕母猪流产、早产及断奶仔猪肺炎、生长迟缓等症状,给养猪业带来严重经济损失。因此,建立能够对PRRSV进行现地快速检测的、简便的诊断方法是十分必要的。本试验采用差速离心和蔗糖密度梯度离心法纯化病毒抗原,按常规方法免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤细胞技术融合小鼠脾细胞与SP2/0细胞,融合率为91.4%。用建立间接ELISA方法检测杂交瘤细胞上清,结果阳性率为20.6%。采用有限稀释法进行3次克隆,获得了5株抗PRRSV单克隆抗体（McAb）,分别命名为D5、D7、D10、E9和B5。5株McAb腹水的效价分别为1:25600、1:12800、1:6400、1:12800和1:6400。免疫球蛋白亚类鉴定结果显示,D5和B5属于IgG2b亚类,D7、D10和E9属于IgM亚类,而其轻链均为κ链。用原核表达的PRRSV N蛋白对家兔进行多次免疫,制备了兔抗PRRSV N蛋白抗体。免疫胶体金诊断试纸条具有快速、简便等优点,结合单克隆抗体技术又有良好的特异性和敏感性,是目前现地应用最广泛的一种诊断方法。本试验利用柠檬酸三钠还原法制备粒径约为20nm的胶体金,选择抗体效价高,反应活性好且亚类为IgG2b的D5 McAb与20nm的胶体金颗粒结合制备探针,同时将纯化的兔抗PRRSV N蛋白抗体和羊抗鼠IgG包被硝酸纤维素膜（NCM）分别作为检测线（T线）和质控线（C线）,组装成检测PRRSV的免疫胶体金诊断试纸条。敏感性试验结果表明,本试验组装的免疫胶体金诊断试纸条可以检出6.25μg/mL纯化的PRRSV抗原。在特异性试验中,用所组装的试纸条对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪圆环病毒2型（PCV2）和猪细小病毒（PPV）进行检测,结果显示,该试纸条只能够检测出PRRSV为阳性,其余均为阴性。在现地试验中,对30份样本进行检测,结果显示,本试验组装的免疫胶体金诊断试纸条检出19份阳性病料,而RT-PCR方法检出21份阳性病料,总符合率为90.0%;阳性符合率为90.5%;阴性符合率为88.9%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒病原学
• 1.1.1 分类地位
• 1.1.2 形态特征
• 1.1.3 理化特性
• 1.1.4 培养特性
• 1.1.5 分子生物学特性
• 1.1.6 遗传变异
• 1.1.7 致病机理
• 1.2 PRRSV 的检测方法
• 1.2.1 病毒的分离与鉴定
• 1.2.2 免疫组织化学法
• 1.2.3 聚合酶链反应（PCR）技术
• 1.2.4 核酸探针原位杂交技术（ISH）
• 1.3 免疫胶体金快速诊断技术的应用
• 1.3.1 免疫胶体金诊断试纸条基本原理
• 1.3.2 免疫胶体金诊断试纸条的优点
• 1.3.3 免疫胶体金诊断试纸条在猪病诊断上的应用
• 1.4 课题研究的背景与意义
• 1.5 研究内容及技术路线
• 1.5.1 研究内容
• 1.5.2 技术路线
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 病毒与细胞
• 2.1.2 实验动物
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要仪器及耗材
• 2.2 方法
• 2.2.1 抗PRRSV McAb 的制备
• 2.2.2 兔抗PRRSV N 蛋白抗体的制备
• 2.2.3 免疫胶体金诊断试纸条的组装
• 2.2.4 免疫胶体金诊断试纸条反应条件的优化
• 2.2.5 免疫胶体金诊断试纸条的性能测试
• 3 结果与分析
• 3.1 抗PRRSV McAb 制备结果
• 3.1.1 PRRSV 抗原的制备
• 3.1.2 间接ELISA 检测方法最佳工作条件的建立
• 3.1.3 小鼠抗体水平检测
• 3.1.4 细胞融合与筛选
• 3.1.5 腹水的制备与纯化
• 3.1.6 McAb 的特性鉴定
• 3.2 兔抗PRRSV N 蛋白抗体制备结果
• 3.3 免疫胶体金诊断试纸条的组装结果
• 3.3.1 胶体金颗粒的质量
• 3.3.2 McAb 最适标记量的测定
• 3.3.3 抗体标记反应时间的确定
• 3.3.4 金标McAb 稳定剂的选择
• 3.3.5 金标McAb 包被量确定
• 3.3.6 NCM 抗体包被量的确定
• 3.3.7 结合垫封闭液的选择
• 3.3.8 样品垫封闭液的选择
• 3.3.9 NCM 封闭液的选择及浓度确定
• 3.4 免疫胶体金诊断试纸条性能测试结果
• 3.4.1 特异性试验
• 3.4.2 敏感性试验
• 3.4.3 保存期
• 3.4.4 现地样本的检测
• 4 讨论
• 4.1 关于抗PRRSV McAb 的制备
• 4.1.1 抗原的制备与动物免疫
• 4.1.2 细胞融合
• 4.1.3 杂交瘤细胞株筛选
• 4.1.4 McAb 的特性鉴定
• 4.2 关于免疫胶体金诊断试纸条的组装
• 4.2.1 胶体金的制备
• 4.2.2 胶体金标记抗体最适pH 值
• 4.2.3 McAb 与胶体金的结合比例
• 4.2.4 NCM 的封闭
• 4.3 关于免疫胶体金的诊断特点和改进方向
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表的论文