小鼠孤雌胚胎干细胞直接向神经细胞诱导分化的实验研究

论文摘要

胚胎干细胞（embryonicst emc ell,ES）是一种从哺乳动物囊胚中获得的全能细胞。胚胎干细胞能在体外特定条件下无限地自我更新并能分化成体内任何一种细胞,因此它在基础研究领域和临床治疗领域都有重要的研究价值。神经退行性疾病（如帕金森,老年性痴呆等）和神经系统损伤（如中风,脑缺血,脊髓损伤等）是多发性疾病。科学家发现神经于细胞（neural Stem Cells,NSCs）移植可以替代死亡或退变的神经元,移植后可明显改善上述疾病的临床症状,这一成果对神经系统损伤修复和退行性疾病的治疗具有划时代的意义。因此,ES细胞向神经方向诱导分化目前成为科学研究的热点。胚胎干细胞有四种来源:一是从正常受精卵形成的囊胚中获得;二是从早期胚胎生殖嵴中获得;三是从核转移途径得到的囊胚中获得;四是从孤雌生殖形成的囊胚中获得。第四种途径产生的胚胎干细胞称为孤雌胚胎干细胞。孤雌胚胎干细胞作为一种特殊的胚胎干细胞有着重要的基础研究和应用价值,普通胚胎干细胞系由于主要组织相容复合物（MHC）在不同个体之间存在显著差异将可能导致移植后免疫排斥,而孤雌胚胎干细胞的MHC等位基因是纯合子,因此从理论上将大大降低免疫排斥的可能性。近来已有文献报道哺乳动物孤雌胚胎干细胞具有向三个胚层细胞分化的能力,因此孤雌胚胎干细胞将来也可以作为细胞治疗的一个来源。目的:探讨小鼠孤雌胚胎干细胞在体外不经过拟胚体（embryoid body,EB）阶段,直接诱导分化为神经细胞的可行性。材料与方法:昆明小鼠品系孤雌胚胎干细胞株mPGES为山东大学省立医院干细胞研究中心自建。该细胞株经微卫星技术检测表明为孤雌来源,碱性磷酸酶呈阳性表达,表面标志物Oct-4（octamer-binding transcription factor-4）、阶段特异性胚胎抗原（stage-specific embryonic antigen,SSEA）-1呈阳性,SSEA-4阴性。表现正常二倍体核型,将mPGES接种于重度联合免疫缺陷（severecombined immune deficiency,SCID）小鼠皮下8周后,出现肿块,病理切片观察可见三个胚层的组织,以上资料表明该细胞株具有胚胎干细胞特性。实验采用阶段诱导的方法,首先由孤雌胚胎干细胞向神经前体细胞定向分化,通过巢蛋白（nestin）免疫荧光细胞化学染色对神经前体细胞进行鉴定。在此基础上,从培养基中撤除bFGF和EGF,加入5%胎牛血清,观察已分化的神经前体细胞能否进一步分化为神经细胞,并对分化出的细胞进行免疫荧光细胞化学鉴定。结果:经选择培养基培养3d后的孤雌胚胎干细胞绝大多数可诱导为神经前体细胞,细胞呈小圆形,枣核状,多有两个突起,在形态学上具有神经前体细胞特征。经nestin鉴定,绝大部分细胞呈nestin阳性。加入血清进一步诱导分化,大约培养10天后,可观察到有神经上皮样细胞存活。经GFAP,B-Ⅲ-tubline鉴定,为β-Ⅲ-tubline阳性,说明存活细胞为早期神经元细胞。结论:（1）本实验室所建的小鼠孤雌胚胎干细胞mPGES经过体外诱导方成功诱导出早期神经元细胞。（2）不经过拟胚体（EB）,直接诱导分化的方法可用于孤雌来源的胚胎干细胞向神经方向的诱导分化,并且在诱导前期可获得大量的神经前体细胞,此方法较EB诱导方法更加简便、直接。（3）孤雌来源的胚胎干细胞有望为老年退行性疾病细胞替代疗法提供广阔的前景。

论文目录

• 符号说明
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 攻读硕士期间发表论文
• 学位论文评阅及答辩情况表